SCAD Testi Kullanarak Yara İzi Gelişimini Görselleştirme - Ex-situ Cilt Yara İzi Tahlili
Summary
Bu protokol, “Bir Çanakta SCar benzeri doku” veya SCAD olarak adlandırılan bir cilt-fasya eksplantının oluşumunu tanımlar. Bu model, skar oluşumu sırasında tek fibroblastların benzeri görülmemiş bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.
Abstract
Memelilerin derin doku yaralarının kapatılmasına verdiği küresel yanıt, özel fasya fibroblastlarının aracılık ettiği skar oluşumu ve doku kasılması yoluyladır. Yara izi oluşumunun ve bozulmuş yara iyileşmesinin klinik önemine rağmen, yara iyileşmesinde fasya fibroblast dinamiklerini anlamamız, fibroblast koreografisinin ve dinamiklerinin cilt yaraları gibi karmaşık ortamlarda doğrudan görselleştirilmesini sağlayan ilgili testlerin bulunmaması nedeniyle üstünkörüdür. Bu yazıda, cilt yaralarının karmaşık ortamını taklit eden SCAD veya “Bir Çanakta SCar benzeri doku” kullanılarak ex-situ cilt izleri oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlilde, 2 mm tam kalınlıkta cilt eksize edilir ve 5 gün boyunca ortamda baş aşağı kültürlenir, bu süre zarfında yara izleri ve cilt kontraktürleri eşit olarak gelişir. Bu metodoloji, fibroblast soyuna özgü transgenik fare modelleri ile birleştiğinde, tüm yara onarım süreci boyunca bireysel fibroblast soylarının görselleştirilmesini sağlar. Genel olarak, bu protokol araştırmacıların yara onarımının temel süreçlerini ve mekanizmalarını anlamalarına, modülatörlerin yara iyileşmesi sonuçları üzerindeki etkilerini doğrudan keşfetmelerine yardımcı olur.
Introduction
Yara iyileşmesi, ihlal edilen yaraların restorasyonu sürecidir. Omurgasızlarda doku yaralanmaları kısmi veya tam rejenerasyonla sonuçlanır. Buna karşılık, memeliler derin yaralanmalara yara izi bırakarak yanıt verirler; bu, ihlal edilen alanı en aza indiren ve aynı zamanda yaralı bölgeyi kalıcı olarak deforme eden yoğun matris lifleri tıkaçları ile yaraları hızlı bir şekilde kapatmak için uyarlanmış bir süreç 1,2,3. Memelilerde büyük deri yanıkları veya derin açık yaralar, hipertrofik veya keloid skarlar gibi patolojik fenotiplere neden olur 4,5. Bu coşkulu yara izleri, klinik ve küresel sağlık sistemleri üzerinde muazzam bir yüke neden olmaktadır. Sadece ABD’de, yara izi yönetimi yıllık yaklaşık 10 milyar dolara mal oluyor 6,7. Bu nedenle, skar oluşumunda rol oynayan temel süreçleri ve mekanizmaları daha iyi anlamak için ilgili metodolojilerin geliştirilmesi gerekmektedir.
Son yıllarda, farelerde yapılan çok çeşitli çalışmalar, belirli cilt bölgelerindeki kökenlerine bağlı olarak farklı fonksiyonel potansiyellere sahip heterojen fibroblast popülasyonlarını ortaya koymuştur 8,9,10. Arka deride, Rinkevich ve ark., 2015, EPF (Engrailed pozitif fibroblast) olarak adlandırılan Engrailed-1’in (En1) erken embriyonik ekspresyonuna sahip spesifik bir fibroblast popülasyonunun, yaralanma üzerine kutanöz skarlaşmaya katkıda bulunduğunu tanımlamıştır. Tersine, engrailed ekspresyon öyküsü olmayan başka bir fibroblast soyu olan Engrailed negatif fibroblast (ENF), skar oluşumuna katkıda bulunmaz8. R26mTmG (En1Cre x R26mTmG) gibi floresan muhabir fare çizgilerine çapraz Cre-driven transgenik fare çizgileri kullanılarak bu En1 soylarının kader haritalanması, EPF ve ENF popülasyonlarının görselleştirilmesine olanak tanır.
Fibroblast göçünü birkaç gün boyunca in vivo olarak incelemek, etik ve teknik kısıtlamalarla sınırlıdır. Ayrıca, skarlaşmada rol oynayan yolları modüle etmek için bileşik, viral ve nötralize edici antikor kütüphanesi ekranları teknik olarak zordur. Daha önce kullanılan in vitro veya ex vivo modeller, gerçek cilt mikro ortamlarında fibroblast göçünü ve skar oluşumunu, skar gelişiminde homojenliği ve in vivo cilt ortamlarını taklit eden doku karmaşıklığını görselleştirme yeteneğinden yoksundur 11,12. Yukarıdaki sınırlamaların üstesinden gelmek için, SCAD (Bir Çanakta SCar benzeri doku) 13,14 olarak adlandırılan bir ex vivo skar testi geliştirdik. Bu basit tahlil, epidermis, dermis ve deri altı fasya bölgelerini içeren 2 mm tam kalınlıkta cildin eksize edilmesi ve serum takviyeli DMSO ortamında 5 güne kadar kültürlenmesiyle gerçekleştirilebilir. SCAD’den üretilen skarlar, in vivo skarların transkriptomik ve proteomik özelliklerini güvenilir bir şekilde çoğaltır. Ek olarak, floresan muhabir fare çizgileriyle kesişen ilgili transgenik fare çizgilerinden (örneğin, En1 fareler) üretilen SCAD’ler, fibroblast göç dinamiklerinin ve yara izi gelişiminin benzeri görülmemiş bir çözünürlükte görselleştirilmesine izin verir. Ayrıca, bu model herhangi bir yüksek verimli uygulama için kolayca uyarlanabilir (örneğin, bileşik kütüphanesi, antikor kütüphanesi veya viral tarama)13,14. Bu makalede, skar gelişiminde hücresel ve matris dinamiklerini incelemek için SCAD’ler ve ardından aşağı akış işleme uygulamaları oluşturmak için optimize edilmiş bir protokolü açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yaralanma sonrası skar oluşumunu anlamak için çeşitli modeller geliştirilmiştir. Bu konuda birçok ilerleme kaydedilmesine rağmen, gerçek mekanizmalar hala net değildir. Önceki tekniğin aksine, SCAD modeli tüm hücre tiplerini ve kutanöz tabakaları içerir, böylece doğal cildin karmaşıklığını korur18,19. Bu metodoloji, skar oluşumunu yönlendiren moleküler mekanizmaları anlamada önemli olan temel veri kümeleri üretebilir. Tahlil, basi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SCAD metodolojisinin geliştirilmesine katkıda bulundukları için Jiang et al. 2020’nin tüm ortak yazarlarına teşekkür ederiz13. Dr. Steffen Dietzel’e ve Ludwig-Maximilans-Universität’teki Biyogörüntüleme çekirdek tesisine Multiphoton sistemine erişim için teşekkür ederiz. Y.R., Else-Kröner-Fresenius-Stiftung (2016_A21), Avrupa Araştırma Konseyi Konsolidatör Bursu (ERC-CoG 819933) ve LEO Vakfı (LF-OC-21-000835) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 10% Tween 20, Nonionic Detergent | Biorad Laboratories | 1610781 | |
| Bovine serum albumin, Cold ethanol fract | Sigma | A4503-50G | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 11039021 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190169 | |
| Epredia Cryostar NX70 Cryostat | Thermo Scientific | ||
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Fisher scientific | J1800AMNZ | Adhesion slides |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL | LIFE Technologies | 10500064 | |
| Fluoromount-G with DAPI | Life Technologies | 00 4959 52 | Mounting medium with DAPI |
| Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length | Fisher Scientific | 12381369 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma | G2500-100G | |
| GlutaMAX Supplement-100 mL | LIFE Technologies | 35050038 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL | LIFE Technologies | 14025092 | |
| Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2 | Ibidi | 11922 | |
| Ibidi Heating system | Ibidi | 10915 | |
| Leica SP8 upright microscope – Multiphoton excitation 680–1300 nm | Leica | Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single) | |
| Non Essential Amino Acids | LIFE Technologies | 11140035 | |
| NuSieve GTG Agarose ,25 g | Biozym /Lonza | 859081 | |
| OCT Embedding Matrix | Carlroth | 6478.1 | |
| Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL | VWR International | 43368.9M | |
| Pen-Strep | Gibco | 15140122 | |
| Stiefel Biopsy-Punch 2 mm | Stiefel | 270130 | |
| Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm | Fisher Scientific | 15654444 | |
| Thimerosal Bioxtra, 97%–101% | Sigma-Aldrich | T8784-1G | |
| Zeiss Axioimager M2 upright microscope | Zeiss |
Referências
- Longaker, M. T., et al. Adult skin wounds in the fetal environment heal with scar formation. Annals of Surgery. 219 (1), 65-72 (1994).
- desJardins-Park, H. E., Foster, D. S., Longaker, M. T. Fibroblasts and wound healing: an update. Regenerative Medicine. 13 (5), 491-495 (2018).
- Jiang, X., Iseki, S., Maxson, R. E., Sucov, H. M., Morriss-Kay, G. M. Tissue origins and interactions in the mammalian skull vault. Biologia do Desenvolvimento. 241 (1), 106-116 (2002).
- Tripathi, S., et al. Hypertrophic scars and keloids: a review and current treatment modalities. Biomedical Dermatology. 4, 11 (2020).
- Martin, P. Wound healing–Aiming for perfect skin regeneration. Science. 276 (5309), 75-81 (1997).
- Correa-Gallegos, D., et al. Patch repair of deep wounds by mobilized fascia. Nature. 576 (7786), 287-292 (2019).
- Sen, C. K. Human wounds and its burden: An updated compendium of estimates. Advances in Wound Care. 8 (2), 39-48 (2019).
- Rinkevich, Y., et al. Identification and isolation of a dermal lineage with intrinsic fibrogenic potential. Science. 348 (6232), 2151 (2015).
- Leavitt, T., et al. Prrx1 fibroblasts represent a pro-fibrotic lineage in the mouse ventral dermis. Cell Reports. 33 (6), 108356 (2020).
- Driskell, R. R., et al. Distinct fibroblast lineages determine dermal architecture in skin development and repair. Nature. 504 (7479), 277-281 (2013).
- Walmsley, G. G., et al. Live fibroblast harvest reveals surface marker shift in vitro. Tissue Engineering. Part C, Methods. 21 (3), 314-321 (2015).
- Hakkinen, K. M., Harunaga, J. S., Doyle, A. D., Yamada, K. M. Direct comparisons of the morphology, migration, cell adhesions, and actin cytoskeleton of fibroblasts in four different three-dimensional extracellular matrices. Tissue Engineering. Part A. 17 (5-6), 713-724 (2011).
- Jiang, D., et al. Injury triggers fascia fibroblast collective cell migration to drive scar formation through N-cadherin. Nature Communications. 11 (1), 5653 (2020).
- Wan, L., et al. Connexin43 gap junction drives fascia mobilization and repair of deep skin wounds. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 97, 58-71 (2021).
- Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. -. L., Ertürk, A. A guidebook for DISCO tissue clearing. Molecular Systems Biology. 17 (3), 9807 (2021).
- Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).
- Ertürk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
- Wilhelm, K. -. P., Wilhelm, D., Bielfeldt, S. Models of wound healing: an emphasis on clinical studies. Skin Research and Technology: Official Journal of International Society for Bioengineering and the Skin (ISBS) [and] International Society for Digital Imaging of Skin (ISDIS) [and] International Society for Skin Imaging (ISSI). 23 (1), 3-12 (2017).
- Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing). The Journal of Investigative Dermatology. 138 (10), 2095-2105 (2018).
