טיהור ביוכימי ואפיון פרוטאומי של ליבות פיבריל עמילואידיות מהמוח
Summary
שיטת טיהור ביוכימית זו עם ניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה מאפשרת אפיון חזק של ליבות פיבריל עמילואידיות, מה שעשוי להאיץ את זיהוי המטרות למניעת מחלת אלצהיימר.
Abstract
תכלילי פיברילאר חלבוניים הם סימני היכר פתולוגיים מרכזיים של מחלות נוירודגנרטיביות מרובות. בשלבים המוקדמים של מחלת האלצהיימר (AD), פפטידים עמילואיד-בטא יוצרים פרוטופיברילים במרחב החוץ-תאי, המשמשים כזרעים הגדלים בהדרגה ומתבגרים לתוך פלאקים גדולים של עמילואיד. למרות ההבנה הבסיסית הזו, הידע הנוכחי על מבנה העמילואיד פיבריל, הרכב ודפוסי התצהיר במוח מוגבל. אחד המחסומים העיקריים היה חוסר היכולת לבודד פיברילי עמילואיד מטוהרים מאוד מתמציות מוח. גישות מבוססות מיקרו-דיסקציה של טיהור זיקה ולכידת לייזר שימשו בעבר לבידוד עמילואידים, אך הן מוגבלות על ידי הכמות הקטנה של החומר שניתן לשחזר. פרוטוקול חדשני וחזק זה מתאר את הטיהור הביוכימי של ליבות פלאק עמילואיד באמצעות סולוביליזציה של נתרן דודציל סולפט (SDS) עם אולטרה-צנטריפוגציה הדרגתית של צפיפות סוכרוז ואולטרה-סוניקציה, ומניב פיברילים טהורים ביותר מחולי AD ומדגמי AD רקמות מוח. ניתוח פרוטאומי מבוסס ספקטרומטריית מסה (MS) מלמטה למעלה של החומר המטוהר מייצג אסטרטגיה חזקה לזיהוי כמעט כל מרכיבי החלבון העיקריים של פיברילי עמילואיד. מחקרים פרוטאומיים קודמים על חלבונים בעמילואיד קורונה חשפו אוסף גדול באופן בלתי צפוי ומגוון מבחינה תפקודית של חלבונים. יש לציין כי לאחר זיקוק אסטרטגיית הטיהור, מספר החלבונים המטהרים במשותף הופחת ביותר מפי 10, מה שמעיד על הטוהר הגבוה של החומר הבלתי מסיס SDS המבודד. כתמים שליליים ומיקרוסקופ אלקטרונים אימונו-זהב אפשרו אישור לטוהר ההכנות הללו. נדרשים מחקרים נוספים כדי להבין את התכונות המרחביות והביולוגיות התורמות לתצהיר חלבונים אלה לתכלילי עמילואיד. יחד, אסטרטגיה אנליטית זו ממוקמת היטב כדי להגביר את ההבנה של ביולוגיה עמילואידית.
Introduction
עמילואיד הוא סידור סופראמולקולרי יציב ביותר שנמצא בפאנל מגוון של חלבונים, שחלקם מובילים לשינויים פתולוגיים1. הצטברות של אגרגטים עמילואידיים תוך או חוץ-תאיים נצפית במספר מחלות נוירודגנרטיביות2. אגרגטי עמילואיד הם הטרוגניים ומועשרים במספר רב של חלבונים ושומנים3. בשנים האחרונות, העניין בפרוטאום העמילואידי עורר עניין רב בקרב מדעני מוח בסיסיים ותרגומים. מספר שיטות פותחו כדי לחלץ ולטהר אגרגטים עמילואידיים מרקמות מוח אנושיות של עכברים ופוסט-מורטם. מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר, מיצוי חיסוני, דה-תאיזציה ובידוד ביוכימי של אגרגטים עמילואידיים הן שיטות נפוצות לחילוץ וטיהור של פלאקים עמילואידים, פיברילים ואוליגומרים 4,5,6,7. רבים מהמחקרים האלה התמקדו בקביעת הרכב החלבון של מרבצי הפיברילארים הדחוסים האלה באמצעות טרשת נפוצה כמותית למחצה. עם זאת, התוצאות הזמינות אינן עקביות, והמספר הגדול באופן מפתיע של חלבונים המטהרים יחד שדווחו בעבר מאתגר לפענוח.
המגבלה העיקרית של הספרות הקיימת המתארת את הפרוטאום של ליבת העמילואיד במוחות של עכברי AD ו-AD היא שהחומר המטוהר מכיל מספר בלתי ניתן לניהול של חלבונים המטהרים יחד. המטרה הכוללת של שיטה זו היא להתגבר על מגבלה זו ולפתח טיהור ביוכימי חזק לבידוד ליבות פיבריל עמילואידיות. אסטרטגיה זו משתמשת בשיטה ביוכימית מבוססת אולטרה-צנטריפוגציה של שיפוע צפיפות סוכרוז שתוארה קודם לכן לבידוד של שברים עמילואידים מועשרים בלתי מסיסים של SDS מרקמות מוח של אדם ועכבר AD שלאחר המוות 8,9. שיטה זו מתבססת על הספרות הקיימת, אך מרחיקת לכת יותר עם אולטרה-סוניזציה ושטיפות SDS כדי להסיר את רוב החלבונים הקשורים לעמילואיד הקשורים באופן רופף, מה שמוביל לבידוד של סיבי עמילואיד מטוהרים מאוד (איור 1). הפיברילים המטוהרים על ידי פרוטוקול זה מתגברים על מספר אתגרים קיימים שנתקלים בהם לעתים קרובות במחקרים מבניים של סיבי עמילואיד המבודדים מתמציות מוח. הדמיה של הפיברילים האלה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) מאשרת את השלמות והטוהר של החומר המטוהר (איור 2). במחקר זה, הפיברילים המבודדים עוברים בדידות ומעוכלים לפפטידים עם טריפסין, וניתוח טרשת נפוצה ללא תווית יכול לחשוף בקלות את זהות החלבונים היוצרים את ליבת הפיבריל. יש לציין כי לחלק מחלבונים אלה יש נטייה מובנית ליצור מכלולים סופראמולקולריים באברונים שאינם קשורים לממברנה. בנוסף, רבים מהחלבונים שזוהו בניתוח של פיברילי עמילואיד-בטא (Aβ) קשורים גם למחלות נוירודגנרטיביות אחרות, מה שמרמז על כך שחלבונים אלה עשויים למלא תפקיד מפתח בפרוטאינופתיות מרובות.
סביר להניח ששיטת SDS/אולטרה-סוניקציה זו לא תשנה או תשבש את מבנה ליבות הפיבריל. החומר המטוהר מתאים גם למגוון רחב של גישות אנליזה פרוטאומיות מלמעלה למטה ומלמטה למעלה ולאסטרטגיות ניתוח מבניות נוספות המבוססות על טרשת נפוצה, כגון הצלבה כימית או חילופי מימן-דאוטריום. ההתאוששות הכוללת בשיטה זו גבוהה יחסית, ולכן מתאימה למחקרים מבניים מפורטים, הדורשים מיקרוגרם למיליגרם של החומר המטוהר. החומר המטוהר מתאים גם למחקרים מבניים באמצעות cryoEM ומיקרוסקופיית כוח אטומי. פרוטוקול זה, בשילוב עם התווית האיזוטופית היציבה של יונקים, יכול להקל על מחקרי תהודה מגנטית גרעינית במצב מוצק (NMR) של מבנה עמילואיד10.
Protocol
Representative Results
Discussion
פיתוח הבנה ברורה של המבנה וההרכב של עמילואידים מאתגר עבור ביולוגים מבניים וביוכימאים בשל המורכבות הביולוגית והמגבלות הניסוייות בחילוץ פיברילים מטוהרים מרקמות מוח AD 16,17. סיבי עמילואיד הם פולימורפיים ברמה המולקולרית, ומראים אוכלוסייה הטרוגנית באורכים ובמ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH R01AG061865 ל- R.J.V. ו- J.N.S. המחברים מודים לחברי קבוצת המחקר ואסאר וסאבאס באוניברסיטת נורת’ווסטרן על דיוניהם המהורהרים. אנו גם מודים מקרב לב לד”ר(ים). אנסגאר סימר וראלף לאנגן באוניברסיטת דרום קליפורניה על התשומות המכריעות שלהם. אנו מודים לד”ר פארידה קורבובה על הכנת דגימות והדמיית מיקרוסקופיית אלקטרונים מכתימה שלילית במרכז למיקרוסקופיה מתקדמת של אוניברסיטת נורת’ווסטרן.
Materials
| Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mm | Thermo Scientific | 164535 | Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used |
| Ammonium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibody | Biolegend | 803001 | |
| anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibody | Biolegend | 800701 | |
| anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibody | IBL America | 10323 | |
| anti-amyloid fibril LOC antibody | EMD Millipore | AB2287 | |
| BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23225 | |
| Bioruptor Pico Plus | Diagenode | B01020001 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| Complete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Dnase I | Thermo Fisher Scientific | EN0521 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | |
| Guanidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| HyperSep C18 Cartridges | Thermo Fisher Scientific | 60108-302 | |
| Integrated Proteomics Pipeline – IP2 | http://www.integratedproteomics.com/ | ||
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| K54 Tissue Homogenizing System Motor | Cole Parmer | Glas-Col 099C | |
| MaxQuant | https://www.maxquant.org/ | ||
| Micro BCA kit | Thermo Fisher Scientific | 23235 | |
| Nanoviper 75 μm x 50 cm | Thermo Scientific | 164942 | |
| Optima L-90K Ultracentrifuge | Beckman Coulter | BR-8101P-E | |
| Orbitrap Fusion TribridMass Spectrometer | Thermo Scientific | IQLAAEGAAPFADBMBCX | |
| Pierce C18 Spin Columns | Thermo Fisher Scientific | 89870 | |
| Precellys 24 tissue homogenizer | Bertin Instruments | P000062-PEVO0-A | |
| ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin Enhancer | Promega | V2072 | |
| RawConverter | http://www.fields.scripps.edu/rawconv/ | ||
| Sodium azide | VWR | 97064-646 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 74255 | |
| Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75002446 | |
| Speed Vaccum Concentrator | Labconco | 7315021 | |
| Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | 15568025 | |
| Trypsin Gold-Mass spec grade | Promega | V5280 | |
| UltiMate 3000 RSLCnano System | Thermo Scientific | ULTIM3000RSLCNANO |
Referências
- Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
- Rambaran, R. N., Serpell, L. C. Amyloid fibrils: abnormal protein assembly. Prion. 2 (3), 112-117 (2008).
- Upadhyay, A., et al. Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges. The Neuroscientist. , (2021).
- Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils. PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).
- Kourelis, T. V., et al. A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques. JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).
- Mangione, P. P., et al. Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies. Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).
- Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
- Roher, A. E., et al. Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer’s disease. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).
- Lu, J. -. X., et al. Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer’s disease brain tissue. Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).
- Tycko, R. Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).
- Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer’s disease. Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).
- Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).
- Spijker, S., Li, K. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).
- Hark, T. J., et al. Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer’s disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals. Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).
- Liu, S., et al. Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions. Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).
- Toyama, B. H., Weissman, J. S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).
- Sundaria, N., et al. Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges. Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).
- Cendrowska, U., et al. Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).
- Seuring, C., et al. Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).
- Close, W., et al. Physical basis of amyloid fibril polymorphism. Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).
- Tycko, R. Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).
- Konstantoulea, K., et al. Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure. The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).
- Hondius, D. C., et al. Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).
- Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).
- Hosp, F., et al. Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington’s disease inclusions reveals widespread loss of protein function. Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).
- Wallace, E. W. J., et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).
- Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles. Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).
- Kepchia, D., et al. Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease brain. Alzheimer’s Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).
- Espay, A. J., et al. Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).
- Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer’s β-amyloid structures. Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).
- Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).
- Michno, W., et al. Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer’s disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics. Science Advances. 7 (25), (2021).
- Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
- Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).
