Experimentelle Virusinfektion bei adulten Stechmücken durch orale Fütterung und Mikroinjektion
Summary
Diese Methodik, die orale Ernährung und intrathorakale Injektionsinfektionen umfasste, konnte den Einfluss von Mitteldarm- und/oder Speicheldrüsenbarrieren auf die Arbovirusinfektion effektiv bewerten.
Abstract
Durch Stechmücken übertragene Viren (MBVs), die infektiöse Krankheitserreger für Wirbeltiere sind, werden von vielen Mückenarten verbreitet und stellen eine ernsthafte Bedrohung für die öffentliche Gesundheit dar. Nach der Aufnahme müssen die Viren die Mitteldarmbarriere der Mücken überwinden, um die Hämolymphe zu erreichen, von wo aus sie sich möglicherweise auf die Speicheldrüsen ausbreiten können. Wenn eine Mücke sticht, werden diese Viren auf neue Wirbeltierwirte übertragen. In ähnlicher Weise kann die Mücke verschiedene Viren aufnehmen. In der Regel kann nur ein winziger Teil der Viren über den Darm in die Speicheldrüsen gelangen. Die Übertragungseffizienz dieser Viren auf die Drüsen wird durch die beiden physikalischen Barrieren beeinflusst, die bei verschiedenen Mückenarten zu finden sind: Mitteldarmbarrieren und Speicheldrüsenbarrieren. Dieses Protokoll stellt eine Methode zum Virusnachweis in Speicheldrüsen von Aedes aegypti nach oraler Nahrungsaufnahme und intrathorakaler Injektionsinfektion dar. Darüber hinaus kann die Feststellung, ob der Darm und/oder die Speicheldrüsen die Virusausbreitung behindern, bei der Risikobewertung von MBVs helfen, die von Aedes aegypti übertragen werden.
Introduction
Durch Stechmücken übertragene Viren (MBVs), eine heterogene Gruppe von RNA-Viren, können in Mückenvektoren persistieren und sich anschließend auf Wirbeltierwirte ausbreiten1. Die klinisch bedeutsamen MBVs sind hauptsächlich in vier Virusfamilien verteilt, nämlich Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae und Peribunyavividae 2,3. In den letzten Jahrzehnten wurden diese Viren auf der ganzen Welt gemeldet und verursachten Probleme für die öffentliche Gesundheit. Als eines der bekanntesten MBVs hat sich das Dengue-Virus (DENV) in den letzten 20 Jahren in über 100 Ländern zum am weitesten verbreiteten neu auftretenden oder wieder auftretenden Arbovirus entwickelt4. Seit der Entdeckung des Zika-Virus (ZIKV) im Landesinneren haben fast alle tropischen und subtropischen Länder und Territorien des Kontinents ZIKV-Infektionen beim Menschen gemeldet5. Um das Risiko einer Virusübertragung abschätzen zu können, haben sich in den letzten Jahren zahlreiche Studien auf die Vektorkompetenz von Stechmücken für diese Viren konzentriert 6,7. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, durch Vektoren übertragene Krankheiten wirksam zu verhindern und zu kontrollieren.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), eine der am leichtesten zu züchtenden Stechmücken im Labor, ist ein wichtiger Vektor von DENV, ZIKV, Chikungunya-Virus (CHIKV) und Gelbfiebervirus (YFV)8. Lange Zeit kam Ae. aegypti nur auf dem afrikanischen Kontinent und in Südostasien vor, hat aber in den letzten Jahren fast alle Kontinente besiedelt9. Darüber hinaus hat die weltweite Häufigkeit von Ae. aegypti kontinuierlich zugenommen, mit einem geschätzten Anstieg von 20 % bis zum Ende des Jahrhunderts10. Von 2004 bis 2009 gab es in China einen deutlichen Anstieg der Ae. aegypti-Vektorkompetenz für DENV aufgrund höherer Tagestemperaturen11. Der Status von Ae. aegypti als pathogener Vektor ist in China deutlich gestiegen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, ist es daher notwendig, die Vektorkompetenz von Ae. aegypti zur Übertragung von Viren zu untersuchen.
Als hämatophager Gliederfüßer durchbohrt die weibliche Stechmücke die Haut eines Wirbeltierwirts und ernährt sich vom Blut. Stechmücken erwerben gelegentlich Viren von virusinfizierten Wirten und übertragen die Viren dann auf einen neuen Wirt. Um die Vektorkompetenz zu bestimmen, werden Stechmücken daher über ein Fütterungssystem in der Laborumgebung mit einem künstlichen Blutmehl gefüttert, das Arboviren enthält12. Einzelne Stechmücken werden einige Tage nach der Infektion in Köpfe, Körper und Speichelsekrete getrennt. Zur Messung der Virusinfektion, -verbreitung und -übertragungsraten wurden Virustiter mittels quantitativer Reverse-Transkriptions-PCR (qRT-PCR) oder Plaque-Assay nachgewiesen. Allerdings entwickeln nicht alle Mücken Mitteldarminfektionen und die Fähigkeit, ein Virus nach der Blutfütterung auf den nächsten Wirt zu übertragen. Es ist mit den physiologischen Barrieren der Mücken verbunden, die das Eindringen von Krankheitserregern in den Körper verhindern und eine wichtige Rolle für ihre angeborene Immunität spielen13. Die Mitteldarmbarrieren, insbesondere die Mitteldarm-Infektionsbarriere (MIB) und die Mitteldarm-Escape-Barriere (MEB), beeinflussen, ob das Virus den Vektor systemisch infizieren kann und mit welcher Effizienz es sich ausbreitet. Es behindert die Analyse der Infektion anderer Gewebe, wie z. B. Speicheldrüsen, die ebenfalls eine Speicheldrüseninfektion aufweisen, und Fluchtbarrieren13,14. Um die Infektion von Mitteldärmen und Speicheldrüsen im Vektor besser charakterisieren zu können, wird hier ein detailliertes Protokoll für die orale Ernährung und intrathorakale Inokulation von Arboviren bei Ae. aegypti vorgestellt. Dieses Protokoll könnte auf zusätzliche Arbovirusinfektionen in einer Vielzahl von Mückenvektoren angewendet werden, wie z. B. die DENV- und ZIKV-Infektion bei Aedes spp., und könnte sich als praktikables Verfahren erweisen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Ziel dieser Methode war es, eine umfassende Risikobewertung für ein durch Stechmücken übertragenes Virus zu ermöglichen, indem die Vektorkompetenz durch orale Ernährung und intrathorakale Inokulation bewertet wurde.
Bei dem oralen Fütterungsexperiment müssen die angeschwollenen Mücken herausgesucht und in einen neuen Behälter umgepflanzt werden, was ein ernsthaftes Risiko für die Bediener darstellt. Der Grund dafür ist, dass jede Mücke, einschließlich nicht infizierter Mücken…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das Wuhan Science and Technology Plan Project (2018201261638501) unterstützt.
Materials
| Aedes aegypti | Rockefeller strain | ||
| Automated nucleic acid extraction system | NanoMagBio | S-48 | |
| BHK-21 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Buckets | |||
| C6/36 cells | National Virus Resource Center, Wuhan Institute of Virology | ||
| Carbon dioxide spray gun | wuhan Yihong | YHDFPCO2 | |
| Centrifugal machine | Himac | CF16RN | |
| CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | Bio-Rad | CFX96 Touch | |
| Ebinur Lake virus | Cu20-XJ isolation | ||
| Formaldehyde | Wuhan Baiqiandu | B0003 | |
| Glove box | |||
| Glucose | Hushi | 10010518 | |
| Immersion oil | Cargille | 16908-1 | |
| Insect incubator | Memmert | HPP750T7 | |
| Low Temperature Tissue Homogenizer Grinding Machine | Servicebio | KZ-III-F | |
| Magnetic Virus Genome Extraction Kit | NanoMagBio | NMG0966-16 | |
| mesh cages (30 x 30 x 30 cm) | Huayu | HY-35 | |
| methylcellulose | Calbiochem | 17851 | |
| mice feedstuff powder | BESSN | BS018 | |
| Microelectrode Puller | WPI | PUL-1000 | PUL-1000 is a microprocessor controlled horizontal puller for making glass micropipettes or microelectrodes used in intracellular recording, patch clamp studies, microperfusion or microinjection. |
| Mosquito net meshes | |||
| Nanoject III Programmable Nanoliter Injector | Drummond | 3-000-207 | |
| One Step TB Green PrimeScript PLUS RT-PCR Kit | Takara | RR096A | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | C10010500BT | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 151140-122 | |
| Petri dishes | |||
| Plastic cupes (7 oz) | Hubei Duoanduo | ||
| Plastic cups (24 oz) | Anhui shangji | PET32-Tub-1 | |
| Plastic disposable droppers | Biosharp | BS-XG-O3L-NS | |
| Refrigerator (-80 °C) | sanyo | MDF-U54V | |
| Replacement Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| RPMI medium 1640 | Gibco | C11875500BT | |
| Screw cap storage tubes (2 mL ) | biofil | FCT010005 | |
| Shallow dishes | |||
| Sponge | |||
| Sterile defibrillated horse blood | Wuhan Purity Biotechnology | CDHXB413 | |
| T75 culture flask | Corning | 430829 | |
| The artificial mosquito feeding system | Hemotek | Hemotek PS6 | |
| The dissecting microscope | ZEISS | stemi508 | |
| The ice plates | |||
| The mosquito absorbing machine | Ningbo Bangning | ||
| The pipette tips | Axygen | TF | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tweezers | Dumont | 0203-5-PO |
Referências
- Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle. Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).
- Sukhralia, S., et al. From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).
- Kuhn, J. H., et al. Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales. Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).
- Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
- Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus. Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).
- Wei, Y., et al. Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).
- Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity. Pathogens. 9 (10), (2020).
- Naslund, J., et al. Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).
- Lwande, O. W., et al. Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics. Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).
- Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios. Fronters in Public Health. 7, 148 (2019).
- Cai, W., et al. The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity. Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).
- Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses. Parasites & Vectors. 13 (1), 188 (2020).
- Kumar, A., et al. Mosquito Innate Immunity. Insects. 9 (3), (2018).
- Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes. Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).
- Xia, H., et al. Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border. Frontiers in Microbiology. 10, (2020).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems. Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR. Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).
- Yang, C., et al. Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus. bioRxiv. , (2022).
- Britton, S., et al. Laboratory-acquired dengue virus infection–a case report. PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324 (2011).
- Weger-Lucarelli, J., et al. Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus. PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101 (2016).
- Elizondo-Quiroga, D., et al. Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus. Scientific reports. 9 (1), 16955 (2019).
