Ex Vivo 마우스 자궁 세포에서 아데노바이러스-Cre 매개 유전자 결실의 오가노이드 모델
Summary
이 프로토콜은 관심있는 유전자에 결실을 품고 있는 마우스 비뇨생식기 오가노이드의 생성 및 특성화의 과정을 기술한다. 상기 방법은 마우스 비뇨생식기 세포 수확, CMV 프로모터로 Cre 발현을 유도하는 아데노바이러스를 이용한 생체외 형질도입, 및 시험관내 및 생체외 특성화를 포함한다.
Abstract
방광암은 특히 유전자 조작 마우스 모델 (GEMMs)에서 과소 연구 된 영역입니다. 조직 특이적 Cre 및 loxP 부위를 갖는 교배 GEMMs는 조건부 또는 유도성 유전자 표적화를 위한 황금 표준이었다. 보다 빠르고 효율적인 실험 모델을 제공하기 위해, 종양 억제제 Trp53, Pten 및 Rb1의 다중 loxP 대립 유전자를 운반하는 아데노바이러스 Cre 및 정상 비뇨생식기 세포를 사용하여 생체외 오가노이드 배양 시스템이 개발된다. 정상적인 비뇨생식기 세포는 삼중 플록스 마우스의 네 개의 방광으로부터 효소적으로 분리된다(Trp53 f/f: Pten f/f: Rb1 f/f). 비뇨생식기 세포는 CMV 프로모터(Ad5CMVCre)에 의해 구동되는 아데노바이러스-Cre로 생체외로 형질도입된다. 형질도입된 방광 오가노이드는 배양되고, 전파되고, 시험관내 및 생체내에서 특성화된다. PCR은 Trp53, Pten 및 Rb1에서 유전자 결실을 확인하는 데 사용됩니다. 오가노이드의 면역형광(IF) 염색은 비뇨생식기 계통 마커(CK5 및 p63)의 양성 발현을 입증한다. 오가노이드는 종양 확장 및 연속 통과를 위해 숙주 마우스에 피하 주사된다. 이종이식편의 면역조직화학(IHC)은 CK7, CK5 및 p63의 양성 발현 및 CK8 및 우로플라킨 3의 음성 발현을 나타낸다. 요약하면, loxP 부위로 조작된 마우스 비뇨생식기 세포로부터의 아데노바이러스-매개 유전자 결실은 정의된 유전적 변경의 종양원성 잠재력을 신속하게 시험하는 효율적인 방법이다.
Introduction
방광암은 남성에서 네 번째로 흔한 암이며 미국에서 매년 80,000 명 이상의 사람들에게 영향을 미칩니다1. 백금 기반 화학 요법은 삼십 년 이상 진행성 방광암 환자를위한 치료의 표준이었습니다. 방광암 치료의 풍경은 최근 FDA (Food and Drug Administration)의 면역 요법 (항 PD-1 및 항 PD-L1 면역 체크포인트 억제제), 에르다 피티닙 (섬유 아세포 성장 인자 수용체 억제제) 및 엔포르투맙 베도틴 (항체 – 약물 접합체)2,3,4의 승인으로 혁명을 일으켰습니다. 그러나, 화학요법 또는 면역요법에 대한 반응을 예측하기 위해 임상적으로 승인된 바이오마커는 이용가능하지 않다. 방광암 진행을 유도하는 메커니즘에 대한 이해를 향상시키고 다양한 치료 양식에 대한 예측 바이오마커를 개발할 수 있는 유익한 전임상 모델을 생성해야 할 절실한 필요성이 있습니다.
방광 번역 연구의 주요 장애물은 인간 방광암 발병기전과 치료 반응 5,6을 재검토하는 전임상 모델의 부족이다. 시험관내 2D 모델(세포주 또는 조건부로 재프로그램된 세포), 시험관내 3D 모델(오가노이드, 3D 프린팅) 및 생체내 모델(이종이식편, 발암물질-유도, 유전자 조작 모델 및 환자 유래 이종이식편)2,6을 포함하는 다수의 전임상 모델이 개발되었다. 유전자 조작된 마우스 모델(GEMMs)은 종양 표현형의 분석, 후보 유전자 및/또는 신호전달 경로의 기계론적 조사, 치료 반응의 전임상 평가6,7을 포함하여 방광암 생물학의 많은 응용에 유용하다. GEMMs는 하나 이상의 종양 억제 유전자에서 유전적 결실을 조절하기 위해 부위-특이적 재조합효소(Cre-loxP)를 이용할 수 있다. 여러 유전자 결실로 원하는 GEMM을 생성하는 과정은 시간이 많이 걸리고 힘들고 비용이 많이 듭니다5. 이 방법의 전반적인 목표는 삼중 플록스 대립 유전자 (Trp53, Pten, 및 Rb1)8을 운반하는 정상 마우스 비뇨 생식기 세포로부터 방광 삼중 녹아웃 (TKO) 모델을 확립하기위한 생체외 Cre 전달의 신속하고 효율적인 방법을 개발하는 것입니다. 생체 외 방법의 가장 큰 장점은 빠른 워크 플로 (수년간의 마우스 번식 대신 1-2 주)입니다. 이 글에서는 플록스 대립유전자, 생체외 아데노바이러스 형질도입, 오가노이드 배양, 면역적격 C57 BL/6J 마우스에서의 시험관내 및 생체내 특성화를 갖는 정상 비뇨생식기 세포를 수확하기 위한 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 플록스 대립 유전자의 임의의 조합을 보유하는 면역적격 마우스에서 임상적으로 관련된 방광암 오가노이드를 생성하는데 추가로 사용될 수 있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
GEMM은 정상 세포에서 시작된 암 모델링의 황금 표준이었으며, 잠재적 인 종양원성 교란 (종양 유전자 활성화 및 / 또는 종양 억제제의 손실)의 결과를 엄격하게 테스트 할 수 있습니다. 여기서, 관심 유전자에 플록스된 대립유전자를 운반하는 정상 마우스 비뇨생식기 세포의 생체외 유전자 편집을 통해 방광암 오가노이드를 생성시키기 위한 신속하고 효율적인 프로토콜이 제공된다. H&E 및 IH…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구 작업은 NIH Grants, K08CA252161 (Q.L.), R01CA234162 및 R01 CA207757 (D.W.G.), P30CA016056 (NCI Cancer Center Core Support Grant), Roswell Park Alliance Foundation 및 Friends of Urology Foundation이 부분적으로 지원했습니다. 원고를 교정해 주신 Marisa Blask와 Mila Pakhomova에게 감사드립니다.
Materials
| 100 μm sterile cell strainer | Corning | 431752 | |
| 1 mL syringe | BD | 309659 | |
| 25G 1.5 inches needle | EXELINT International | 26406 | |
| Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml) | UI Viral Vector Core | VVC-U of Iowa-5-HT | |
| C57 BL/6J | Jackson Lab | 000664 | |
| Charcoal-stripped FBS | Gibco | A3382101 | |
| Collagenase/hyaluronidase | Stemcell Technologies | 07912 | |
| Dispase | Stemcell Technologies | 07913 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| L-glutamine substitute (GlutaMAX) | Gibco | 35-050-061 | |
| Mammary Epithelial Cell Growth medium | Lonza | CC-3150 | |
| Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel) | Corning | CB-40234 | |
| Monoclonal mouse anti-CK20 | DAKO | M7019 | IF 1:100 |
| Monoclonal mouse anti-CK7 | Santa Cruz Biotechnology | SC-23876 | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-p63 | Abcam | ab735 | IHC 1:100, IF 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Upk3 | Fitzgerald | 10R-U103A | IHC 1:50 |
| Monoclonal mouse anti-Vimentin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6260 | IF 1:100 |
| Monoclonal rat anti-CK8 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I-s | IF 1:100 |
| HERAcell vios 160i CO2 incubator | Thermo Fisher | 51033557 | |
| Polyclonal chicken anti-CK5 | Biolegend | 905901 | IF 1:500 |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | |
| Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme) | Thermo Fisher | 12605036 | |
| Signature benchtop shaking incubator Model 1575 | VWR | 35962-091 | |
| Specimen Processing Gel (HistoGel) | Thermo Fisher | HG-4000-012 | |
| Surgical blade size 10 | Integra Miltex | 4-110 | |
| Sorvall T1 centrifuge | Thermo Fisher | 75002383 | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
Referências
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