Het meten van eencellig mitochondriaal DNA-kopienummer en heteroplasmie met behulp van digitale druppelpolymerasekettingreactie
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het meten van absolute mitochondriale (mt) DNA-kopienummer en mtDNA-deletie heteroplasmieniveaus in enkele cellen.
Abstract
Het mitochondriaal (mt)DNA van zoogdieren is een klein, circulair, dubbelstrengs, intra-mitochondriaal DNA-molecuul, dat codeert voor 13 subeenheden van de elektronentransportketen. In tegenstelling tot het diploïde nucleaire genoom, bevatten de meeste cellen veel meer kopieën van mtDNA, variërend van minder dan 100 tot meer dan 200.000 kopieën, afhankelijk van het celtype. MtDNA-kopienummer wordt steeds vaker gebruikt als biomarker voor een aantal leeftijdsgebonden degeneratieve aandoeningen en ziekten, en dus wordt nauwkeurige meting van het mtDNA-kopienummer een belangrijk hulpmiddel in zowel onderzoeks- als diagnostische instellingen. Mutaties in het mtDNA, vaak optredend als single nucleotide polymorfismen (SNP’s) of deleties, kunnen ofwel voorkomen in alle kopieën van het mtDNA in de cel (homoplasmie genoemd) of als een mengsel van gemuteerde en WT mtDNA-kopieën (heteroplasmie genoemd). Heteroplasmatische mtDNA-mutaties zijn een belangrijke oorzaak van klinische mitochondriale pathologie, hetzij bij zeldzame ziekten of bij een groeiend aantal veel voorkomende ziekten met late aanvang, zoals de ziekte van Parkinson. Het bepalen van het niveau van heteroplasmie in cellen is een cruciale stap in de diagnose van zeldzame mitochondriale ziekten en in onderzoek gericht op het begrijpen van veel voorkomende late-onset aandoeningen waarbij mitochondriën een rol kunnen spelen. MtDNA-kopienummer en heteroplasmie worden traditioneel gemeten door kwantitatieve (q)PCR-gebaseerde assays of deep sequencing. De recente introductie van ddPCR-technologie heeft echter een alternatieve methode opgeleverd voor het meten van beide parameters. Het biedt verschillende voordelen ten opzichte van bestaande methoden, waaronder de mogelijkheid om het absolute mtDNA-kopieernummer te meten en voldoende gevoeligheid om nauwkeurige metingen uit afzonderlijke cellen uit te voeren, zelfs bij lage kopieeraantallen. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd dat de meting van het mtDNA-kopienummer in afzonderlijke cellen beschrijft met behulp van ddPCR, voortaan aangeduid als druppelgeneratie PCR, met de optie voor gelijktijdige meting van heteroplasmie in cellen met mtDNA-deleties. De mogelijkheid om deze methode uit te breiden om heteroplasmie te meten in cellen met mtDNA SNP’s wordt ook besproken.
Introduction
Zoogdier mitochondriaal (mt)DNA is een klein (ca. 16,5 Kb), circulair DNA-genoom dat zich bevindt in de mitochondriale matrix die codeert voor 37 genen, bestaande uit twee rRNA’s, 22 tRNA’s en 13 eiwitcoderende genen1. In tegenstelling tot het nucleaire genoom, dat één (haploïde) of twee (diploïde) kopieën van elk gen per cel bevat, is mtDNA aanwezig in meerdere kopieën in de mitochondriën van elke cel, variërend van tientallen kopieën (bijv. Volwassen spermatocyten) tot honderdduizenden kopieën (bijv. Eicellen)2,3. Een gevolg van deze multi-copy aard is dat mutaties in het mtDNA-genoom, dat kan bestaan als single-nucleotide polymorfismen (SNP’s), deleties of duplicaties, op verschillende niveaus in een bepaalde cel aanwezig kunnen zijn, die ergens tussen 0% en 100% van de totale mtDNA-populatie van de cel uitmaken. Het bestaan van wild-type en mutante mtDNA-genomen in dezelfde cel wordt heteroplasmie genoemd en pathogene heteroplasmatische mtDNA-mutaties zijn een belangrijke oorzaak van mitochondriale ziekte, met verschillende veel voorkomende neurologische syndromen die verband houden met onderliggende heteroplasmatische mtDNA-mutaties4.
Twee belangrijke parameters die bijdragen aan de waarschijnlijkheid van een heteroplasmatische mtDNA-mutatie die klinische ziekte veroorzaakt, zijn heteroplasmieniveau en het mtDNA-kopienummer. Veel heteroplasmatische mutaties vertonen een drempeleffect, waarbij biochemische en klinische fenotypen pas zichtbaar worden boven een bepaald heteroplasmieniveau, meestal rond 80%5, en vervolgens verergeren naarmate de heteroplasmie verder toeneemt4. Het is echter ook belangrijk om rekening te houden met het aantal kopieën van mtDNA dat in de cel aanwezig is, omdat dit van invloed is op het aantal wild-type (d.w.z. ‘gezonde’) mtDNA-genomen die aanwezig zijn op een bepaald heteroplasmieniveau. Studies bij patiënten met mitochondriale ziekten hebben het belang van dit samenspel tussen heteroplasmie en kopienummer 5,6 benadrukt, en Filograna et al. meldden onlangs een toename van het mtDNA-kopienummer dat de symptomen verlichtte ondanks onveranderde heteroplasmie in een muismodel van mitochondriale ziekte7.
Hoewel er de afgelopen jaren veel is gedaan om het begrip van de pathogenese en overdracht van ziekten veroorzaakt door mtDNA-heteroplasmie te verbeteren, is het grootste deel van dit werk uitgevoerd op het niveau van weefsels in plaats van cellen, waarbij gemiddelde weefselheteroplasmieniveaus en kopienummermetingen worden vergeleken die zijn verkregen uit bulkweefselbiopten en bloedmonsters. Sommige gevestigde technieken, zoals laser capture microdissectie, maken dergelijke metingen op cellulair niveaumogelijk 8,9; de recente explosie van high-throughput single-cell analysemethoden, of zogenaamde “Single-cell Omics”10, heeft echter een behoefte gecreëerd aan methoden die deze cruciale mtDNA-parameters op het niveau van één cel nauwkeurig kunnen meten.
De PCR-methode voor druppelgeneratie maakt gebruik van recente ontwikkelingen in microfluïdische technologie om bestaande methoden voor het kwantificeren van onbekende DNA-concentraties te verbeteren via PCR-amplificatie van specifieke doelamputten in het MONSTER-DNA11. In tegenstelling tot qPCR, waarbij het monster-DNA in een enkele reactie wordt versterkt, waarbij de relatieve accumulatiesnelheid van PCR-product fungeert als de uitlezing, splitst deze methode het eerste monster in duizenden individuele druppeltjes, waardoor de MONSTER-DNA-moleculen worden gecompartimenteerd in ruimtelijk gescheiden reacties12. De daaropvolgende PCR-reactie verloopt in elke afzonderlijke druppel, waarbij het PCR-product zich alleen ophoopt in druppeltjes die het doel-DNA bevatten. Het resultaat van deze reactie is een digitale output in de vorm van een pool van druppeltjes die ofwel een kopie van het doel-DNA en het versterkte PCR-product bevatten, ofwel geen doel-DNA bevatten. Met behulp van fluorescerende DNA-sondes of een dubbelstrengs (ds)DNA-bindende kleurstof kunnen de druppels met versterkt product worden geteld en kan de verhouding tussen ‘positieve’ en ‘negatieve’ druppels worden gebruikt om het absolute aantal DNA-kopieën te berekenen dat aanwezig was in het eerste monster. Deze absolute meting, in tegenstelling tot de relatieve meting verkregen door een qPCR-reactie, is de belangrijkste factor die het mogelijk maakt deze methodologie te gebruiken voor nauwkeurige meting van mtDNA-kopienummer en heteroplasmie in enkele cellen11, en verschillende recente studies hebben al gebruik gemaakt van druppelgeneratie PCR-technologie voor dit doel13,14 . Dit artikel presenteert een methode voor het meten van mtDNA-kopienummer en deletie-heteroplasmie in afzonderlijke cellen van zowel menselijk als muisweefsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol is van toepassing op een breed scala aan celtypen en soorten naast de hierboven besproken, hoewel zorgvuldige optimalisatie van nieuwe testontwerpen de sleutel zal zijn om ervoor te zorgen dat de nauwkeurigheid en herhaalbaarheid van de methode behouden blijven wanneer u weggaat van eerder gevalideerde primer / probe-combinaties. Bij het werken met afzonderlijke cellen is het van vitaal belang om ervoor te zorgen dat de monsterverzameling zo nauwkeurig mogelijk wordt uitgevoerd (bijvoorbeeld …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dank aan Dr. L Bozhilova voor advies over de statistische analyse van PCR-gegevens voor druppelgeneratie. Dank aan Dr. H Zhang voor het verstrekken van de eicellen die worden gebruikt om gegevens te genereren in figuur 3C pt figuur 4B. Dit werk werd uitgevoerd door SPB van de Medical Research Council Mitochondrial Biology Unit (MC_UU_00015/9), Universiteit van Cambridge, en gefinancierd door een Wellcome Trust Principal Research Fellowship gehouden door PFC (212219 / Z / 18 / Z).
Materials
| 50% Tween-20 solution | Novex | 3005 | |
| Automated droplet-generating oil | Bio Rad | 1864110 | Commercial oil formulation used to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.1) |
| C1000 PCR machine with deep-well block | Bio Rad | 1851197 | PCR thermocycler equipped with a deep-well heating block, used for cell lysis (Protocol Step 2.1.2.) and PCR cycling (Protocol Step 5) |
| Collection plate cooling block | Bio Rad | 12002819 | Cooling block that keeps samples chilled during droplet generation (used in Protocol step 4.3) |
| ddPCR 96-well plates | Bio Rad | 12001925 | 96-well plates pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator, used for sample preparation (Protocol step 3.4) and droplet collection (Protocol step 4.3) |
| ddPCR droplet reader oil | Bio Rad | 1863004 | Commercial oil formulation used by the droplet reader (used in Protocol step 6.1) |
| ddPCR Supermix for Probes (no dUTP) | Bio Rad | 1863023 | Commercial supermix for use in ddPCR experiments utilising probes (used in Protocol Step 3.3) |
| DG32 automated droplet generator cartridges | Bio Rad | 1864108 | Microfluidic cartridges used in the QX200 AutoDG droplet generator to generate the oil/droplet emulsion (used in Protocol Step 4.3) |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Qualified fetal bovine serum |
| Foil plate covers | Bio Rad | 1814040 | Foil plate covers used to seal droplet collection plates after droplet generation (used in Protocol step 4.6) |
| HEK 293T cells | Takara | 632180 | Commercial subclone of the transformed human embryonic kidney cell line, HEK 293, expressing the SV40 Large-T antigen |
| HeLa cells | ECACC | 93021013 | Human cervix epitheloid carcinoma cells |
| High glucose DMEM | Gibco | 13345364 | 4.5g/L D-Glucose, with L-glutamine and sodium pyruvate |
| Human cybrids | University of Miami | ||
| Mouse embryonic fibroblasts | Newcastle University | Immortalized from C57Bl/6 mice | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PCR plate seals | Pierce | SP-0027 | Clear adhesive plate seals, only used pre-droplet generation (foil seal must be used in step 4.6) |
| Pipet Tip Waste Bins | Bio Rad | 1864125 | Disposable collection bin used to collect discarded tips in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Pipet tips for AutoDG system | Bio Rad | 1864120 | Filtered pipet tips designed for use in the QX200 AutoDG droplet generator (used in Protocol step 4.3) |
| Primary human dermal fibroblast cells | Newcastle Biobank | ||
| Primers/Probes | IDT | N/A | Exact primer/probe sequences will be assay dependent. Primers and probes used in this study are given in Table 1 |
| Proteinase K 20 mg/mL solution | Ambion | AM2546 | |
| PX1 PCR plate sealer | Bio Rad | 1814000 | Applies foil seals to ddPCR sample plates after droplet generation (used in Protocol Step 4.6) |
| QX Manager software | Bio Rad | 12012172 | Droplet reader set up & analysis software (used in Protocol Steps 6 & 7) |
| QX200 AutoDG droplet generator | Bio Rad | 1864101 | Automated microfluidic droplet generator (used in Protocol Step 4) |
| QX200 droplet reader | Bio Rad | 1864003 | Droplet reader (used in Protocol Step 6) |
| Trizma pre-set crystals pH 8.3 | Sigma | T8943-100G | |
Referências
- Taanman, J. W. The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication. Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).
- Wai, T., et al. The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility. Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).
- D’Erchia, A. M., et al. Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity. Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).
- Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
- Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A–>G. American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).
- Liu, H., et al. Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases. PloS One. 8 (6), 67146 (2013).
- Filograna, R., et al. Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse. Science Advances. 5 (4), (2019).
- Wang, Y., et al. The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues. Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).
- Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF). American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).
- Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods. Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).
- Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data. Scientific Reports. 7 (1), 2409 (2017).
- Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
- Herbst, A., et al. Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes. Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).
- O’Hara, R., et al. Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution. Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).
- Diaz, F., et al. Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control. Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).
- Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells. Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).
- Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis. Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).
- Perier, C., et al. Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms. Brain. 136, 2369-2378 (2013).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).
- Cree, L. M., et al. A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes. Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).
- Belmonte, F. R., et al. Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions. Scientific Reports. 6, 25186 (2016).
- Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. Two direct repeats cause most human mtDNA deletions. Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).
- Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation. Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).
- Macaulay, I. C., et al. Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq. Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).
- Ludwig, L. S., et al. Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics. Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).
- Rooney, J. P., et al. PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species. Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).
- Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression. Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).
- Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases. Scientific Reports. 10 (1), 10821 (2020).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: A Technology Review. Sensors (Basel). 18 (4), (2018).
- Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane. ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).
- Li, Z., et al. Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care. Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952 (2021).
