Summary
현재 프로토콜은 클로르헥시딘 글루코네이트(CG) 유발 복막 섬유증의 복막 투석(PD) 마우스 모델을 설정합니다. 현재 모델은 다른 PD 동물 모델에 비해 간단하고 사용하기 쉽습니다.
Abstract
복막 섬유증은 복막 투석(PD)의 중요한 합병증입니다. 이 문제를 조사하고 해결하기 위해서는 PD의 적절한 동물 모델이 필요합니다. 본 프로토콜은 PD 환자의 상태를 모방하는 클로르헥시딘 글루코네이트(CG) 유도 복막 섬유증 모델을 설정합니다. 복막 섬유증은 수컷 C57BL/6 마우스에서 총 9회 동안 3주 동안 15% 에탄올에 0.1% CG를 복강내 주사하여(격일로 투여) 유도했습니다. 그런 다음 22일째에 복막 기능 테스트를 수행했습니다. 생쥐를 희생시킨 후, 복벽의 정수리 복막과 간의 내장 복막을 적출 하였다. 그들은 Masson의 삼색 염색 후 현미경으로 분석했을 때 더 두껍고 섬유질적이었습니다. 한외여과율은 감소하였고, 포도당 질량수송은 CG에 의해 유도된 복막 투과성의 증가를 나타내었다. 이렇게 확립된 PD 모델은 PD 기술을 개선하고, 투석 효능을 개선하고, 환자 생존을 연장하는 데 응용할 수 있다.
Introduction
복막 투석(PD)은 일종의 신대체 요법입니다. 그러나 PD는 해결할 수 없는 문제가 있다. 예를 들어, 장기간의 PD 치료는 복막 손상을 야기할 수 있고, 결국 한외여과 실패 및 치료 중단을 초래할 수 있다(1,2,3,4,5,6). 복막 섬유증은 가장 심각한 합병증중 하나입니다 7,8. 복막 섬유증은 간질 내 세포외 기질의 침착 및 축적, 복막의 신혈관신생 및 혈관병증을 특징으로 한다 9,10.
이러한 복막 변화의 주요 원인은 재발성 복막염 및 투석액의 비생체적합성이며, 이는 고삼투압, 고포도당, 낮은 pH 및 포도당 분해 생성물 축적이다11,12. 따라서 적절한 동물 실험 모델은 연구자들이 PD 치료 중 복막의 생리학적 및 병리학적 변화를 더 잘 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 PD 기술 및 투석 효능을 향상시키고 환자의 생존을 연장하기 위해서는 동물 PD 모델을 구축하는 것이 중요합니다. 이 연구는 앞서 설명한 바와 같이 클로르헥시딘 글루코네이트(CG)의 복강내(i.p.) 주사에 의해 PD 마우스 모델을 생성하는 것을 목표로 했습니다 13,14. 이 PD 마우스 모델은 다른 PD 동물 모델에 비해 간단하고 사용하기 쉬우며 실현 가능합니다.
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Protocol
모든 마우스 실험은 E-DA Hospital/I-Shou University의 Laboratory Animal Center의 승인을 받았으며 "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals"(NRC, USA 2011)에 따라 처리되었습니다. 7-8주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 본 연구에 사용하였다.
1. 화학 약품 준비
- 0.1% 클로르헥시딘 글루코네이트(CG, 재료 표 참조)를 15% 에탄올에 희석하여 화학적 자극제를 준비합니다.
2. 동물 치료
- 세 마리의 마우스를 대조군으로 지정합니다. 0.9% 생리식염수(NS) 1mL/kg을 3주 동안 격일로 총 9회 복강주사(ip)한다.
- 복막 섬유증 그룹에 3 마리의 마우스를 할당하십시오. 12.5μL/g 체중의 용량으로 15% 에탄올(1.1단계)에 0.1% CG를 주사하여 클로르헥시딘 글루코네이트(CG)를 사용하여 복막 섬유증을 유도합니다. 이것을 3 주 동안 격일로 총 9 번 수행하십시오.
3. 복막 기능 검사 (복막 평형 시험 변형)
- 4.25% 포도당을 함유하는 투석액을 준비한다. 투석액 시료 0.5mL를 주사기로 채취한 후 투석액 시료의 포도당 농도를 확인합니다.
참고: 포도당 농도는 헥소키나제/G6PD 방법에 따라 결정됩니다. 투석액 샘플을 L-형 Glu2 분석에 접근하고 생화학적 분석기로 조사하였다( 재료 표 참조). 이것은 초기 투석액 포도당 농도입니다. - 20μL/20gw의 용량으로 Zoletil과 Xylazine(부피 1:2 비율로 준비, 재료 표 참조)을 근육내 주사하여 마우스를 마취합니다. 또한 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용하십시오.
- 투석 용액(2mL/20g 체중)의 점적 수행.
- 30분 후 발가락 꼬집음 반사가 없는 상태에서 마취 깊이를 평가하고 확인합니다. 그런 다음 복부 정중선 (xiphoid process) 아래에서 수직 절개를 수행 한 다음 마우스의 복부를 열고 주사기 ( "볼륨 1"로 정의 됨)로 복강 내 액을 수집합니다. 그런 다음 깨끗하고 마른 면의 무게를 측정하고 면봉을 생쥐의 복강에 넣어 잔류 복강 내액을 흡수합니다. 마지막으로 면 무게를 다시 측정합니다.
참고: 면화의 체중 증가는 잔류 복강내액의 무게와 같습니다. 그런 다음 얻은 부피(비중: 1g/cm3, "부피 2"로 정의됨)로 변환합니다. 최종 투석액의 양은 1권에 2권을 더한 것입니다. - 0.5mL의 투석액 샘플(최종 투석액)을 사용하여 포도당 농도를 측정합니다. 이것이 최종 투석액 포도당 농도입니다.
- 화학식15를 사용하여 순 한외여과를 계산합니다.
- 다음 식15를 사용하여 복막 투과도를 계산합니다.
4. 복벽 근육과 간의 조직 준비 및 조직학적 분석
- 심장 천자 (정맥 절개술)를 통해 생쥐를 희생하십시오.3,16.
- 복벽 (1cm x 1cm)을 자르고 전체 간 절제술을 받으십시오. 생쥐의 복벽과 간 조직을 10% 중성 완충 포르말린에 하룻밤 동안 고정합니다.
- 복벽 근육과 간의 3μm 두께의 파라핀 절편을 준비하고 이전에 발표된 보고서17에 따라 조직학적 분석을 수행합니다.
- 복벽의 정수리 복막과 마우스의 간 표면의 내장 복막을 형태 측정법을 사용하여 평가한다18.
- 통계 및 그래프 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다( 재료 표 참조). 모든 데이터를 평균± SD로 표현하고 t-검정19를 사용하여 통계적 유의성을 분석합니다. P < 0.05인 값을 유의한 결과로 정의합니다.
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Representative Results
그림 1A,B에서 복벽의 정수리 복막은 Masson의 삼색 염색17에서 현저하게 두껍고 섬유화되었으며, 이는 CG 노출 그룹에서 복막 섬유증이 대조군 식염수 그룹(NS)보다 더 심각함을 나타냅니다. 그림 2A,B에서 간 표면의 내장 복막도 현저하게 두껍고 섬유화되어 CG 노출 그룹에서 복막 섬유증이 대조군 식염수군(NS)보다 더 심하다는 것을 증명합니다. 도 3A에서, 한외여과율은 CG 군에서 감소하고, 글루코스 질량수송은 CG 유도군에서 복막 투과성이 증가함을 나타내었다(도 3B).
그림 1: 복막 투석(PD) 마우스 모델에서 복벽의 정수리 복막의 섬유증. (A) CG에 노출된 그룹의 경우 Masson의 삼색 염색 하에서 대조군(NS)보다 복막 섬유증이 더 심합니다. (B) (A)의 정량화된 데이터는 표준 편차 n≥ 3± 평균으로 표현됨; P < 0.01입니다. (A)의 경우 스케일 바 = 100μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 복막 투석(PD) 마우스 모델에서 간 표면의 내장 복막의 섬유화. (A) CG에 노출된 그룹의 경우 복막 섬유증이 Masson의 삼색 염색 하에서 대조군(NS)보다 더 심합니다. (B) (A)의 정량화된 데이터는 표준 편차 n≥ 3± 평균으로 표현됨; P < 0.005입니다. (A)의 경우 스케일 바 = 100μm입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: PD 마우스 모델의 복막 기능 저하 . (A) 클로르헥시딘 글루코네이트 노출군(CG)에서, 한외여과율은 대조군 식염수군(NS)보다 현저히 낮았다. (B) 포도당 질량 수송은 또한 CG가 복막 투과성의 증가를 유도한다는 것을 나타내었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차, n≥ 3으로 표시되고; P < 0.005입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본 연구에서는 마우스 PD 모델을 i.p. CG를 주사하고, 그 결과 이 모델에서 복막 섬유증과 기능 저하가 나타나 PD 환자의 상태를 모방하였다.
프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, CG 또는 NS의 i.p. 주사를 수행하기 위해서는 천자로 인한 복강 내 장기 손상을 방지하기 위해 집게를 사용하여 마우스의 복벽 피부를 집어 올려야 합니다. 둘째, 조직학적 분석을 위해 복벽의 복막을 채취하는 동안 i.p. 주사로 손상된 부위는 피해야 합니다.
복막 섬유증의 여러 실험 동물 모델 중 가장 일반적인 것은 사용 편의성과 적응성 때문에 CG 모델입니다. Suga et al.20 은 1995년에 CG 유도 복막 섬유증 쥐 모델을 처음으로 보고했습니다. i.p. 2mL의 식염수에 용해된 0.1% CG와 15% 에탄올을 26일 동안 매일 주사했습니다. IshiI et al.21 은 C57BL/6 마우스를 사용하고 식염수 IP 주사에 용해된 15% 에탄올과 함께 0.1% CG 0.3mL를 투여했습니다. 총 56일 동안 마우스에서 실험적 경화 캡슐화 복막염이 유발되었습니다. Nishino et al.22는 28일 동안 식염수 2mL 에 용해된 15% 에탄올에 매일 0.1% CG를 주사한 Wistar 쥐를 사용했습니다. Mishima et al.23 은 같은 해에 Sprague-Dawley(SD) 쥐에서 복막 섬유증을 유도하기 위해 유사한 방법을 사용했습니다. Kushiyama et al.24 는 SD 쥐를 사용하여 식염수(체중 1.5mL/체중 100g)에 용해된 15% 에탄올에 0.1% CG를 투여했습니다. Nishino 등[25]은 생쥐를 매일 사용하였으며, 15% 에탄올에 0.1% CG를 주사하여 복강내로 투여하고, 0.2mL 의 식염수에 용해시켜 7일 및 15일 동안 투여하였다. Lua et al.26 은 참기름에 유화한 타목시펜을 12.5mg/mL로 에탄올에 용해시킨 다음 i.p. 3일 간격 동안 100mg/g 체중으로 마우스에 주사했습니다. 2주 후, 15% 에탄올/인산염 완충 식염수(1.5mL/100g)에 0.1% CG를 격일로 총 10회 투여하여 생쥐에 주사했습니다. Yoh et al.14는 SD 랫트를 사용하여 식염수에 용해된 15% 에탄올에 0.1% CG 체중 1.5mL/100g 을 21일 동안 주 3회 주사했습니다. Yoh et al. 10 주 된 마우스를 사용하여 15 % 에탄올 i.p. 주사로 0.1 % CG (0.01 ml / g 체중)를 총 21 일 동안 일주일에 세 번 주사했다. 같은 해에 lo et al.13 도 비슷한 방법을 사용했습니다.
현재 모델에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 본 동물모델에서는 투석액 대신 복막 섬유화로 인한 기능 저하를 유도하기 위한 화학적 자극제로 CG를 사용하였다. CG는 화학적 자극제이며 반복 투여는 중피 세포의 변성 및 염증 반응을 유발하여 과도한 섬유증을 유발할 수 있습니다. 염증 및 혈관신생이 관찰되었고, 이러한 소견은 파킨슨병 환자에서 관찰된 것과 유사하였다. CG 주사는 복막이 상당히 두꺼워지지만, 이전 연구에서는 피브린 침착이 상대적으로 약한 것으로 나타났다27. 둘째, 본 연구에 사용된 마우스는 신장 질환이 없었습니다. 결과적으로 복막에 대한 요독 독소의 영향을 평가할 수 없었습니다. 셋째, 복막의 염증, 혈관신생 및 세포외 기질 침착을 평가하지 않았다. 그러나, 이전 연구13에 따르면, 동일한 동물 모델은 이미 CG 노출 후 F4/80 양성 세포와 CD31 양성 혈관의 수가 모두 증가한 것으로 나타났습니다. 따라서 이 동물모델에서 얻은 결과는 복막투석 환자에서 PD의 상태를 완전히 나타낼 수 없다는 점에 유의해야 합니다. 파킨슨병 환자에서 복막 손상의 메커니즘은 복잡하며 다른 패턴을 따를 수 있습니다.
이러한 모든 한계에도 불구하고, 본 모델은 PD의 다른 동물 모델에 비해 간단하고, 사용하기 쉬우며, 이전 연구(3,13,14,16,18,25)에 따라 실현 가능하다. 이 방법은 PD 현장 연구에 적용할 수 있는 PD 관련 복막 섬유증 모델을 나타냅니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 Shin-Han Tseng에게 비판적인 토론과 연구의 부분적인 실행에 진심으로 감사드립니다. 이 연구는 E-DA 병원 연구 재단과 대만 국립 청쿵 대학교의 EDAHP110003 및 NCKUEDA110002의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Normal Saline | Y F CHEMICAL CORP., New Taipei City, Taiwan | - | |
| 10% neutral buffered formalin | Taiwan Burnett International Co., Ltd., Taipei City, Taiwan | 00002A | |
| Automatic biochemical analyzer | Hitachi Ltd., Tokyo, Japan | Labospect Series 008 | for determining glucose concentration |
| Chlorhexidine digluconate solution, 20% in H2O | Sigma-Aldrich, MO, USA | C9394 | diluted to 0.1% with 15% ethanol for injection |
| Ethanol | Avantor Performance Materials, LLC, PA, USA | BAKR8006-05 | diluted to 15% with normal saline for working concentration |
| Glucose (Dianeal) | Baxter International, Inc., IL, USA | FNB9896 | Commercial dialysis solution (4.25%) |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software, Inc., CA, US | ||
| L-type Glu 2 assay | FUJIFILM Wako, Japan | 461-32403 | |
| Xylazine 20 | Juily Pharmaceutical Co., Ltd., New Taipei City, Taiwan | - | |
| Zoletil 50 | Virbac Laboratories, Carros, France | - |
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