הדפסה ביולוגית רב-כיוונית קרמית במתלים עמוסי תאים ליצירת אנלוגים לעצם
Summary
פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדפסה תלת-ממדית לייצור מבנים דמויי עצם על ידי הפקדת דיו סידן פוספט בתמיכה גרעינית מבוססת ג’לטין. אנלוגי עצם מודפסים מופקדים בצורה חופשית, עם גמישות לקציר ישיר של ההדפסה או crosslinking בתוך מטריצת תא חי עבור מבנים multiphasic.
Abstract
מבחינה מבנית, רקמת העצם היא תרכובת אנאורגנית-אורגנית המכילה תאים פעילים מטבולית המוטבעים בתוך מטריצה היררכית ומינרלית מאוד. ארגון זה מאתגר לשכפול בשל הסביבה ההטרוגנית של העצם. הדפסה ביולוגית רב-כיוונית קרמית במתלי תאים (COBICS) היא טכניקת הדפסה ביולוגית מבוססת מיקרוג’ל המשכפלת באופן ייחודי את המבנה המינרלי והתאי של העצם. COBICS מדפיסה מבנים מורכבים ורלוונטיים ביולוגית ללא צורך בחומרי תמיכה להקרבה או בשלבים קשים לאחר העיבוד (למשל, קרינה וסינטר בטמפרטורה גבוהה), שהם שניים מהאתגרים הגדולים ביותר בייצור תוספים של מבנים מחקים עצם. טכניקה זו מתאפשרת באמצעות שחול חופשי של דיו חדשני על בסיס סידן פוספט בתוך תרחיף מיקרוג’ל על בסיס ג’לטין. תכונות עקת התשואה של התרחיף מאפשרות תצהיר ותומכות במבנה העצם המודפס. UV crosslinking וננו-משקעים ואז “נועלים” אותו במקומו. היכולת להדפיס קרמיקה ננו-מובנית של עצם-חיקוי בתוך ביו-חומרים עמוסי תאים מספקת שליטה מרחבית-טמפורלית על ארכיטקטורת מאקרו ומיקרו ומקלה על ייצור בזמן אמת של מבני עצם מורכבים בסביבות קליניות.
Introduction
לעצם יש יכולות התחדשות יוצאות דופן כאחד המבנים הבודדים בגוף שיכולים להחלים על ידי שחזור ההרכב התאי הרגיל שלה, האוריינטציה והחוזק המכני עד לגודל פגם קריטי, כאשר יכולת הריפוי האנדוגנית נפגעת1. העצם, יחד עם הסחוס והרצועות, תומכת ומקלה על תנועת הגוף, תוך אחסון מינרלים ושומנים וייצור תאי דם. כרקמת חיבור קשה וצפופה, העצם מורכבת בעיקר משלב אנאורגני, מים וחומר אורגני המורכב בעיקר מסיבי קולגן2. תאים מוטבעים בתוך מטריצה מינרלית מאוד זו של סיבי קולגן I וגבישי הידרוקסיאפטיט (HA), ויוצרים מבנה היררכי3.
הארגון המורכב של רקמה זו הופך את הייצור של חלופות סינתטיות כדי לשכפל את סביבות המיקרו והננו-סביבה ההטרוגניות של העצם למאתגרות במיוחד3. לשם כך הוצעו מגוון חומרים, כולל ביו-קרמיקה, הידרוג’לים עמוסי תאים וחומרים סינתטיים כפתרונות ליצירת מטריצות עצם. בין טכניקות ייצור הפיגומים, טכניקות מבוססות הדפסה תלת-ממדית התפתחו לאחרונה וקיבלו תשומת לב רבה מקהילת הנדסת הרקמות בשל יכולתן יוצאת הדופן לאפשר ייצור של מבנים מתוחכמים ומדויקים ביותר עם הבטחה גדולה לטיפול ספציפי למטופל 4,5,6 . הידרוג’לים הם הבחירה הפופולרית ביותר של חיקויים של מטריקס וביו-דיו מכיוון שניתן להדפיס אותם יחד עם תאים ומולקולות ביו-אקטיביות, וליצור מבנים פונקציונליים6. עם זאת, הידרוג’לים חסרים את התכונות הפונקציונליות של העצם, כגון חוזק מכני ופאזה אנאורגנית מאוד מסולסלת המכילה תאים פעילים מטבולית.
פיגומים קרמיים מודפסים בתלת-ממד דורשים בדרך כלל שלבים לאחר העיבוד, כולל סינטר, טיפולים בטמפרטורות גבוהות או שימוש בכימיקלים קשים שיש לשטוף ביסודיות לפני יישומי in vitro או in vivo 5. כדי להתמודד עם מגבלות אלה, Lode et al.7 פיתחו לאחרונה משחה מבוססת α טריקלציום פוספט שנוצרה על ידי הידרוקסיאפטיט, שניתן להדפיס ולהגדיר בתנאים פיזיולוגיים. עם זאת, חומר זה עדיין לא יכול להיות מודפס יחד עם תאים חיים כפי שהוא דורש לאחר הטיפול בסביבה לחה ולאחר מכן טבילת תמיסה מימית במשך תקופה ארוכה.
לחלופין, הידרוג’ל עמוס תאים עם חלקיקים אנאורגניים ששולבו הוצע כתחליף למטריצת עצם תלת-ממדית 8,9. למרות יכולתם הרבה לתמוך בחיוניות התאים, הם אינם מסוגלים לשחזר את סביבת רקמת העצם המינרלית הצפופה. Thrivikarman et al.10 אימצו גישה ביומימטית שבה נעשה שימוש במדיום סידן ופוספט על-רווי עם אנלוגיה של חלבון שאינו קולגן כדי לחקות טוב יותר את תצהיר האפטיט הננומטרי. עם זאת, המבנים שלהם עדיין לא יכולים ליצור מבנים תלת-ממדיים קשיחים עם ארכיטקטורה בקנה מידה של מיקרו ומאקרו הדומה לעצם.
המחקר הנוכחי מטפל בליקויים אלה באמצעות פיתוח אסטרטגיית הדפסה לייצור מבנים מחקי עצם, בפאזה אנאורגנית ואורגנית, המסוגלים לשלב הן תאים והן גורמי גדילה11. COBICS משחזר באופן ייחודי את המבנה המינרלי והתאי של העצם באמצעות טכניקת הדפסה ביולוגית מבוססת מיקרוג’ל. הפרוטוקול שלהלן מתאר את תהליך הסינתזה של מיקרו-ג’לים מבוססי דיו עצם וג’לטין ולאחר מכן שילוב תאים המאפשרים COBICS. התהליך מתחיל בסינתזה של החומר המבשר העיקרי של דיו העצם. לאחר מכן, ההידרוג’ל הניתן לקישור צולב מסונתז ונוצר למיקרו-ג’לים. לבסוף, דיו העצם מופקד באופן רב-כיווני באמבט תמיכה של המיקרו-ג’לים העמוסים בתאים (איור 1).
ניתן להדפיס את דיו העצם לתוך כל השעיה של microgels שיש להם את המאפיינים המתאימים תשואה מתח, כלומר, את היכולת fluidize בקצב גזירה מסוים ולאחר מכן לתמוך במבנה המופקד. שתי גישות גמישות הודגמו: תרחיף המורכב ממיקרו-ג’ל ג’לטין ותרחיף המורכב ממיקרו-ג’ל ג’לטין מתקרילט (GelMA). ההשעיה הראשונה מתמוססת כאשר הטמפרטורה עולה ל -37 מעלות צלזיוס, ההטבעה ההפיכה החופשית של טכניקת הידרוג’לים תלויים (FRESH)12, בעוד שהאחרונה יכולה לעבור פוטוקרוסלינק לאחר ההדפסה, למעשה “לתפור” את המיקרוג’לים יחד ולנעול את דיו העצם המודפס במקומו. המחקר הנוכחי מתמקד בשימוש ב-GelMA כמטריצה, שכן הוא מספק את היתרון הייחודי של היכולת לתמוך בצמיחת תאים עם הדפסה באתרה של מבנים מימטיים מורכבים של העצם. בסופו של דבר, גישה זו מאפשרת יצירת מודלים מורכבים של רקמות עם רמות גבוהות של ביומימיקריה והשלכות רחבות על מידול מחלות, גילוי תרופות והנדסה רגנרטיבית.
איור 1: סכמטי של זרימת העבודה . (A) דיו העצם מסונתז החל מסינתזה של α-טריקלציום פוספט והשילוב הבא שלה עם גליצרול, פוליסורבט 80 ואמוניום פוספט דו-בסיסי. (B) מיקרו-ג’לים של GelMA מיוצרים בשיטת תחליב המים בשמן. המיקרו-ג’לים המתקבלים הם לאחר מכן (C) מיובשים ו-(D) משולבים עם תאים. לאחר מכן משתמשים בחומרים מרוכבים של תאים-מיקרוג’ל כאמבטיה גרגירית שבה מופקד דיו העצם. (E) המבנה כולו מועבר לאחר מכן להצלבת UV ומועבר לחממה לתרבית. קיצורים: α-TCP = α-טריקלציום פוספט; GelMA =ג’לטין מתקרילט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקת ההדפסה התלת-ממדית COBICS פותחה כדי לאפשר ייצור של מבנים דמויי עצם שעברו מינרליזציה באמצעות שחול לתוך תרחיף מיקרוג’ל הניתן להצלבה המכיל תאים חיים. הטכניקה יושמה על תרחיף מיקרוג’ל מתכלה, והתאים מראים יכולת כדאיות, התפשטות והתמיינות אוסטאוגנית טובה בתוך המערכת11. גורם מרכזי ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות למועצה הלאומית לבריאות ולמחקר רפואי (מענק מס’ GNT1111694 ו-GNT1141602) ולמועצת המחקר האוסטרלית (מענק מס’ FT180100417, FL150100060 ו-CE14100036). המחברים מבקשים להודות למתקן ההדמיה הביו-רפואית באוניברסיטת ניו סאות’ ויילס. הדמויות נוצרו באמצעות Biorender.com, Adobe Photoshop ו-Adobe Illustrator ויוצאו תחת מנוי בתשלום.
Materials
| 3D Printer Extruder | Hyrel3D | EMO-25 | |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | BDAA352070 | |
| Absolute Ethanol 100% Denatured | Chem-Supply | ||
| Acetone | Chem-Supply | 154871 | |
| Alumina crucible | Coors | ||
| Ammonium phosphate dibasic (NaHPO4) | Sigma | A5764 | |
| Autodesk Fusion 360 | Autodesk | ||
| Biosafety cabinet level 2 | |||
| Calcium carbonate | Sigma | 239216 | |
| Calcium hydrogen phosphate (CaHPO4) | Sigma | C7263 | |
| Cell culture flasks | Corning | various volumes used | |
| Cellulose Dialysis Tubes, 14 kDa cut-off | Sigma | D9777 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5430R | |
| Centrifuge | Sigma | 3-16KL | |
| Dispensing Tip, 23 G | Nordson | 7018302 | |
| DMEM, low glucose, pyruvate | Thermo FIsher | 11885084 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo FIsher | 14190144 | |
| Elevator furnace | Labec | ||
| Engine HR Multihead Printer | Hyrel3D | ||
| Fetal Bovine Serum | Bovogen | ||
| Gelatin type A, from porcine skin | Sigma | G2500 | |
| General Purpose Stainless Steel Tips | Nordson EF | ||
| Glycerol | Sigma | G9012 | |
| Human adipose derived stem cells | ATCC | PCS-500-011 | |
| LSM 800 Confocal Microscope | ZEISS | ||
| Lyophilizer (Alpha 1-4 LDplus) | Christ | 101541 | |
| Magnetic hot plate and stirrer | |||
| Methacrylic anhydride | Sigma | 276685 | |
| Mini 2 Desktop 3D Printer | LulzBot | ||
| Parafilm sealing film | Parafilm | PM996 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo FIsher | 15140122 | |
| Planetary ball mill | |||
| Planetary ball mill jar | |||
| Polyoxyethylenesorbitan monooleate Tween-80 | Sigma | P6224 | |
| Scanning electron microscope | FEI Nova NanoSEM 450 FE-SEM | ||
| Science Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimtech | 18813156 | |
| Stainless steel standard test sieve | |||
| Sunflower Oil | Community Co | ||
| Trypsin-EDTA 0.25% phenol red | Thermo FIsher | 25200056 | |
| ZEN Microscope Software | ZEISS | ||
| Live/Dead viability/ cytotoxicity kit for mammalian cells | Invitrogen | L3224 | |
| DMEM, low glucose, no phenol red | Thermo Fisher | 11054020 |
Referências
- Bates, P., Ramachandran, M. Bone injury, healing and grafting. Basic Orthopaedic Sciences. The Stanmore Guide. , 123-134 (2007).
- Lin, X., et al. The bone extracellular matrix in bone formation and regeneration. Frontiers in Pharmacology. 11, 757 (2020).
- Reznikov, N., et al. A materials science vision of extracellular matrix mineralization. Nature Reviews Materials. 1, 16041 (2016).
- Kang, H. W., et al. A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity. Nature Biotechnology. 34 (3), 312-319 (2016).
- Lin, K., et al. 3D printing of bioceramic scaffolds-Barriers to the clinical translation: From promise to reality, and future perspectives. Materials. 12 (17), 2660 (2019).
- Qu, M., et al. Multi-dimensional printing for bone tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 10 (11), 2001986 (2021).
- Lode, A., et al. Fabrication of porous scaffolds by three-dimensional plotting of a pasty calcium phosphate bone cement under mild conditions. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 8 (9), 682-693 (2014).
- Bernal, P. N., et al. Volumetric bioprinting of complex living-tissue constructs within seconds. Advanced Materials. 31 (42), 1904209 (2019).
- Diloksumpan, P., et al. Combining multi-scale 3D printing technologies to engineer reinforced hydrogel-ceramic interfaces. Biofabrication. 12 (2), 025014 (2020).
- Thrivikraman, G., et al. Rapid fabrication of vascularized and innervated cell-laden bone models with biomimetic intrafibrillar collagen mineralization. Nature Communications. 10 (1), 3520 (2019).
- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), 1500758 (2015).
- Phromsopha, T., Baimark, Y. Preparation of starch/gelatin blend microparticles by a water-in-oil emulsion method for controlled release drug delivery. International Journal of Biomaterials. 2014, 829490 (2014).
- Moreno, D., et al. Solid-state synthesis of alpha tricalcium phosphate for cements used in biomedical applications. Boletín de la Sociedad Española de Cerámica y Vidrio. 59 (5), 193-200 (2020).
