הרדמה ואינטובציה של גורי עכברים טרום-סוכרתיים לניתוחי לב-חזה
Summary
מודלים ניתוחיים לבביים בעכברים בני >7 ימים דורשים אינטובציה, אך זה מאתגר עבור גורי עכברים טרום-אשפוזיים (בני 8-14 יום) ויש מעט מידע על משטרי הרדמה לאינטובציה. כאן אנו מציגים משטרי מינון של קטמין/קסילזין/אטרופין בגורי עכברים C57BL/6J בני 10 ימים המאפשרים אינטובציה אנדוטרכאלית, תוך מזעור תמותת בעלי חיים.
Abstract
מודלים כירורגיים של מורין ממלאים תפקיד חשוב במחקר פרה-קליני. תובנות מכניסטיות על התחדשות שריר הלב לאחר פגיעה לבבית ניתן לקבל ממודלים של ניתוחי לב-חזה בעכברים בני 0-14 יום, שהקרדיומיוציטים שלהם, בניגוד לאלה של מבוגרים, שומרים על יכולת הרבייה. גורי עכברים עד גיל 7 ימים משותקים ביעילות על ידי היפותרמיה ואינם דורשים אינטובציה לניתוח לב-חזה. גורי עכברים טרום-מתבגרים (בני 8-14 יום), לעומת זאת, דורשים אינטובציה, אך זה מאתגר ויש מעט מידע לגבי הרדמה כדי להקל על אינטובציה. כאן אנו מציגים משטרי מינון של קטמין/קסילזין/אטרופין בגורי עכברים C57BL/6J בני 10 ימים המאפשרים אינטובציה אנדוטרכאלית, תוך מזעור תמותת בעלי חיים. טיטרציה אמפירית של משטרי מינון קטמין/קסילזין/אטרופין למשקל הגוף הצביעה על כך שהתגובה להרדמה של גורי עכברים במשקלים שונים הייתה לא ליניארית, לפיה מינונים של 20/4/0.12 מ”ג/ק”ג, 30/4/0.12 מ”ג/ק”ג ו-50/6/0.18 מ”ג/ק”ג הקלו על אינטובציה של גורים במשקל שבין 3.15-4.49 גרם (n = 22), 4.50-5.49 גרם (n = 20), ו-5.50-8.10 גרם (n = 20), בהתאמה. גורים במשקל גוף נמוך יותר נזקקו ליותר ניסיונות אינטובציה מאשר גורים כבדים יותר (עמ’ < 0.001). הישרדות לאחר אינטובציה מתואמת עם משקל הגוף (59%, 70% ו-80% עבור קבוצות משקל נמוך, בינוני וגבוה, בהתאמה, R2 = 0.995). עבור ניתוח אוטם שריר הלב לאחר אינטובציה, מישור כירורגי של הרדמה הושרה עם 4.5% איזופלורן ב 100% חמצן ונשמר עם 2% איזופלוראן ב 100% חמצן. ההישרדות לאחר הניתוח הייתה דומה עבור שלוש קבוצות המשקל עם 92%, 86% ו-88% (p = 0.91). יחד עם שיפורים בשיטות הטיפול בבעלי חיים עבור אינטובציה וניתוח, ומזעור קניבליזציה על ידי הסכר לאחר הניתוח, ההישרדות הכוללת של ההליך כולו (אינטובציה בתוספת ניתוח) מתואמת עם משקל הגוף (55%, 60% ו -70% עבור קבוצות משקל נמוך, בינוני וגבוה, בהתאמה, R2 = 0.978). לאור הקושי בו נתקלים באינטובציה של גורים בני 10 ימים והתמותה הגבוהה הנלווית לכך, אנו ממליצים להגביל ניתוחי לב-חזה בגורים בני 10 ימים לגורים במשקל של 5.5 גרם לפחות.
Introduction
מודלים של מורין הם כלים שלא יסולא בפז במחקר קרדיו-ריאה פרה-קליני, בפרט בגלל הקלות שבה ניתן ליצור קווי עכברים מהונדסים גנטית, וגם את הקלות שבה ניתן לתמרן את העכברים בניתוח כדי לספק מודלים של מחלות פתולוגיות כדי לאפשר, למשל, את המחקר של התחדשות שריר הלב לאחר פגיעה לבבית1 . בהקשר זה, מעניין שבניגוד לעכברים בוגרים שבהם קרדיומיוציטים נסוגו ממחזור התא, לבבות עכברים יילודים בני 0-2 ימים מתקנים עם הצטלקות מינימלית לאחר כריתה אפית או אינדוקציה של אוטם שריר הלב 2,3,4. לעומת זאת, לבבות ילודים בני 7 ימים מתחדשים באופן חלקי עם שכיחות גבוהה יותר של צלקות 2,3. מאחר שקרדיומיוציטים בקצה החדר השמאלי שומרים על יכולת ההתרבות עד שבועיים לאחר הלידה, מחקרים מכניסטיים של התחדשות לאחר פגיעה לבבית בעכברים בני 0-14 יום עשויים להיות אינפורמטיביים לזיהוי מטרות טיפוליות להתחדשות הלב הבוגר הפצוע5.
פיתוח מודלים של עכברים של פגיעה בלב כרוך מניפולציה כירורגית תחת הרדמה. זה דורש לפתוח את בית החזה כדי לגשת ללב, אשר בדרך כלל מחייב אינטובציה והנשמה מכנית. מאמץ העכבר, משקל הגוף והגיל משפיעים על הרגישות לחומרי הרדמה6. ניתן להרדים עכברים בוגרים עם מגוון רחב של חומרים, משטר נפוץ לאינטובציה הוא קטמין/קסילזין/אטרופין ב-100/13/0.5 מ”ג/ק”ג 6,7. עכברים ילודים (בני 0-7 ימים) חסרים רפלקס כאב מרכזי, וניתן לשתק אותם ביעילות על קרח ולעבור ניתוח ללא אינטובציה 6,8,9. לא ניתן להרדים גורי עכברים טרום-מתבגרים (בני 8-14 יום) עם היפותרמיה 9,10; הם דורשים אינטובציה לניתוח לב-חזה. אין מחקרים קודמים על ניתוחי לב-חזה בעכברים טרום-דורסניים בני פחות מ-14 יום. מניסיוננו, אינטובציה של עכברים טרום-מתבגרים שעברו הרדמה של איזופלורן מתחת לגיל 14 היא קשה. משטר ההרדמה המומלץ בהזרקה המדווח לעכברים מעל 7 ימים הוא 50-150 מ”ג/ק”ג קטמין ו-5-10 מ”ג/ק”ג קסילזין10. עכברים טרום-מתבגרים עדיין מתפתחים מבחינה נוירולוגית ותגובותיהם לתרופות ולמטבוליזם של תרופות שונות מאוד מחיות בוגרות6. זה מהווה סיכון מוגבר לחוסר איזון בנוזלים, אלקטרוליטים וחומצה-בסיס, כמו גם היפוגליקמיה והיפותרמיה בשל לא רק קצב חילוף החומרים הגבוה שלהם, אשר מרוקן במהירות את מאגרי האנרגיה המוגבלים שלהם, אלא גם בשל חוסר הבשלות התרמורגולטורית שלהם 6,11,12. לכן, יש מעט מידע על משטרי הרדמה כי הן להקל על אינטובציה למקסם את ההישרדות של עכברים preadolescent.
כאן תיקנו באופן אמפירי את משטרי המינון של קטמין/קסילזין/אטרופין בגורי עכברים C57BL/6J בני 10 ימים, שמשקלם נע בין 3-8 גרם כדי להשיג מישור הרדמה מספיק כדי לאפשר אינטובציה אנדוטרכאלית לניתוחי לב-חזה הבאים, תוך מזעור תמותת בעלי חיים. כמו כן, שיכללנו את שיטות הטיפול בבעלי חיים כדי להפחית את התמותה מאינטובציה, ניתוחים וקניבליזם אימהי לאחר ניתוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
נכון לעכשיו, אין שיטות מתועדות היטב להרדמה ואינטובציה של עכברים בני 10 ימים לניתוחי לב-חזה. לשם כך, ביצענו משטרי מינון קטמין/קסילזין/אטרופין למשקל הגוף, לפיהם מינונים של 20/4/0.12 מ”ג/ק”ג, 30/4/0.12 מ”ג/ק”ג ו-50/6/0.18 מ”ג/ק”ג הקלו על אינטובציה של גורים עם משקל גוף נמוך (3.15-4.49 גרם), בינוני (4.50-5.49 גרם) וגבוה (5.50-8.1…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק תוכנית NHMRC [ID 1074386], מענק רשת טרנס-אטלנטית של מצוינות במחקר לב וכלי דם [RMG], ומענק מקרן RT Hall [RMG & SEI].
Materials
| Atipamezole (Antisedan) | Provet (NSW) Pty Ltd | ATIP I | |
| Atropine 600 mcg/mL | Clifford Hallam Healthcare Pty Ptd | 1957699 PFIZER-0143386 | |
| Betadine | Livingstone International | BU0520 | |
| Buprenorphine (Temgesic) | Provet (NSW) Pty Ltd | TEMG I | |
| Fiber-optic light | Leica | 3011350 | CLS 150X |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, LLC | Version 9.1.2 | |
| Intubation platform | – | – | Any sturdy box (e.g. plastic tip box) with approximate dimensions 12 (L) x 8.5 x (W) x 7.5 cm (H) |
| Isoflurane | Provet (NSW) Pty Ltd | ISOF 07 | |
| Ketamine 100 mg/mL | Provet (NSW) Pty Ltd | KETAI1 | |
| Plastic intravenous cannula 24-gauge Polywin Safety | BD Insyte | CE0086 | 19 mm length of plastic tubing (0.7 mm outer diameter) attached to a 21mm plastic female luer lock adaptor; total volume of annula 130 μL |
| Single lumen polyethylene tube | Critchley Electrical Products Pty Ltd Auburn NSW | Outer diameter 0.61 mm, inner diameter 0.28 mm | |
| Small forceps | F.S.T. | NO 11051-10 | |
| Surgical microscope (camera optional) | Leica | M651 (Leica IC80 HD camera) | 10x and 16x objective |
| Suture 7-0 prolene | Ethicon | 8708H | |
| Suture 9-0 polypropylene monofilament | Ethicon | 2813 | |
| V-1 Tabletop with Active Scavenging isoflurane anesthesia systm | VetEquip | 901820 | |
| Vented 2-Liter plexiglass induction chamber | VetQuip Pty Ltd | 942102 | 25 cm (L) x 13 cm (W) x 11 cm (H) |
| Warming lamp | Brilant Lighting | 99223 | |
| Xylazine | Provet (NSW) Pty Ltd | XYLA Z 2 |
Referências
- Klocke, R., Tian, W., Kuhlmann, M. T., Nikol, S. Surgical animal models of heart failure related to coronary heart disease. Cardiovascular Research. 74 (1), 29-38 (2007).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Naqvi, N., et al. A proliferative burst during preadolescence establishes the final cardiomyocyte number. Cell. 157 (4), 795-807 (2014).
- Bogush, N., et al. DUSP5 expression in left ventricular cardiomyocytes of young hearts regulates thyroid hormone (T3)-induced proliferative ERK1/2 signaling. Scientific Reports. 10 (1), 21918 (2020).
- Flecknell, P. . Laboratory Animal Anaesthesia. Third edition. , (2009).
- Iismaa, S. E., et al. Cardiac hypertrophy limits infarct expansion after myocardial infarction in mice. Scientific Reports. 8 (1), 6114 (2018).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- . Anesthesia and Analgesia: Neonatal Mice and Rats Available from: https://www.bu.edu/researchsupport/compliance/animal-care/working-with-animals/anesthesia/anesthesia-and-analgesia-neonatal-mice-and-rats-iacuc/ (2019)
- . Mouse-Specific Anesthesia Guidance Available from: https://research.utexas.edu/qpcontent/uploads/sites/7/2020/02/Mouse_Anesthesia_guidance_ARC_112519.pdf (2019)
- Paddleford, R. . Manual of Small Animal Anaesthesia. Second edition. , (2000).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Daubenspeck, J. A., Li, A., Nattie, E. E. Acoustic plethysmography measures breathing in unrestrained neonatal mice. Journal of Applied Physiology. 104 (1), 262-268 (2008).
- Lim, R., et al. Measuring respiratory function in mice using unrestrained whole-body plethysmography. Journal of Visulaized Experiments. (90), e51755 (2014).
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. Journal of Applied Physiology. 87 (6), 2362-2365 (1999).
- Du, X. -. J., Gao, X., Ramsey, D. Surgical methods of inducing transverse aortic stenosis and myocardial infarction in the mouse. Asia Pacific Heart Journal. 7 (3), 187-192 (1998).
- Wu, J., et al. Anesthesia and intubation of 10-Day old C57BL/6J mouse pups for cardiothoracic surgery. Research Square. , (2021).
- Silver, L. M. Mouse Genetics: Concepts and Applications. Mouse Genome Informatics, The Jackson Laboratory. , (2008).
- West, G. B., Woodruff, W. H., Brown, J. H. Allometric scaling of metabolic rate from molecules and mitochondria to cells and mammals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 2473-2478 (2002).
- Moscovitz, J. E., Aleksunes, L. M. Establishment of metabolism and transport pathways in the rodent and human fetal liver. International Journal of Molecular Science. 14 (12), 23801-23827 (2013).
- Blevins, C. E., Celeste, N. A., Marx, J. O. Effects of oxygen supplementation on injectable and inhalant anesthesia in C57BL/6 mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 60 (3), 289-297 (2021).
