Un semplice protocollo di analisi dei pozzi per visualizzare e quantificare il riassorbimento osteoclastico in vitro
Summary
Qui, presentiamo una procedura di analisi semplice ed efficace per i saggi di riassorbimento della fossa utilizzando piastre di coltura cellulare rivestite di fosfato di calcio.
Abstract
Gli osteoclasti maturi sono cellule multinucleate che possono degradare l’osso attraverso la secrezione di acidi ed enzimi. Svolgono un ruolo cruciale in varie malattie (ad esempio, l’osteoporosi e il cancro alle ossa) e sono quindi importanti oggetti di ricerca. In vitro, la loro attività può essere analizzata dalla formazione di pozzi di riassorbimento. In questo protocollo, descriviamo un semplice metodo di analisi dei pozzi che utilizza piastre di coltura cellulare rivestite di fosfato di calcio (CaP), che possono essere facilmente visualizzate e quantificate. I precursori degli osteoclasti derivati da cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) sono stati coltivati sulle piastre rivestite in presenza di stimoli osteoclastogeni. Dopo 9 giorni di incubazione, gli osteoclasti sono stati fissati e colorati per l’imaging a fluorescenza mentre il rivestimento CaP è stato controcolorato dalla calceina. Per quantificare l’area riassorbita, il rivestimento CaP sulle piastre è stato colorato con AgNO3 al 5% e visualizzato mediante imaging a campo luminoso. L’area della fossa di riassorbimento è stata quantificata utilizzando ImageJ.
Introduction
Gli osteoclasti (OC) sono macrofagi tessuto-specifici derivati da cellule staminali ematopoietiche (HSC), che svolgono un ruolo fondamentale nel rimodellamento osseo insieme agli osteoblasti1. I disturbi ossei indotti da ormoni sessuali, immunologici e maligni che distruggono l’osso a livello sistemico o locale sono dovuti all’eccessiva attività osteoclastica, tra cui l’osteoporosi correlata alla menopausa2, l’artrite reumatoide3, la malattia parodontale4, la malattia ossea del mieloma5 e le metastasi ossee osteolitiche6. Al contrario, i difetti nella formazione e nella funzione dell’OC possono anche causare osteopetrosi7. Le HSC subiscono la differenziazione in progenitori OC sotto stimolazione del fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF, simbolo genico ACP5). In presenza sia di M-CSF che di attivatore recettoriale del ligando NF-κB (RANKL, simbolo genico TNFSF11), i progenitori OC si differenziano ulteriormente in OC mononucleati e successivamente si fondono per diventare OC multinucleati 8,9,10. Entrambe le citochine M-CSF e RANKL sono indispensabili e sufficienti per l’induzione di marcatori osteoclastici come il recettore della calcitonina (CT), l’attivatore del recettore del fattore nucleare κ B (RANK), la pompa protonica V-ATPasi, la subunità alfa del canale del cloruro 7 (CIC-7), l’integrina β3, la fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP, simbolo genico ACP5), la cisteina lisosomiale proteasi catepsina K (CTSK) e la metallopeptidasi 9 della matrice (MMP9). Gli OC attivati formano una zona di tenuta sulla superficie ossea attraverso la formazione di un anello di actina con un bordo arruffato11,12. All’interno della zona di tenuta, gli OC mediano il riassorbimento attraverso la secrezione di protoni tramite la pompa protonica V-ATPasi 12,13, MMP914 e CTSK15, portando alla formazione di lacune.
Per esperimenti in vitro, i progenitori oc possono essere ottenuti mediante espansione di macrofagi del midollo osseo dal femore e dalla tibia16,17 dei topi, nonché mediante isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC) da campioni di sangue e buffy coat 18,19,20, o mediante differenziazione delle cellule monocitiche murine immortalizzate RAW 264.7 21,22.
Nel presente protocollo, descriviamo un saggio di riassorbimento osteoclastico in piastre di coltura cellulare rivestite di CaP utilizzando OC derivati da PBMC primari. Il metodo delle piastre di coltura cellulare rivestite di CaP qui utilizzato è adottato e perfezionato dal metodo descritto in precedenza da Patntirapong et al.17 e Maria et al.21. Per ottenere precursori OC, i PBMC vengono isolati mediante centrifugazione a gradiente di densità ed espansi come descritto in precedenza20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui descriviamo un metodo semplice e affidabile per un test di riassorbimento osteoclastico utilizzando OC derivati ed espansi in vitro da PBMC. Le piastre di coltura cellulare rivestite in CaP utilizzate possono essere facilmente preparate e visualizzate utilizzando materiali disponibili in laboratorio. Oltre alle PBMC non selezionate adottate in questo protocollo, anche le OC generate da cellule monocitiche murine21 e cellule macrofagiche del midollo osseo17 sono…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato parzialmente finanziato dal China Scholarship Council [CSC No. 201808440394]. W.C. è stato finanziato dal CSC.
Materials
| AgNO3 | SERVA Electrophoresis GmbH | 35110 | Silver nitrate |
| a-MEM | Gibco | 32561-029 | MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides |
| amphotericin B | Biochrom | 03-028-1B | Amphotericin B Solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21097-50G | Calcium chloride Dihydrate |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | Calcein |
| FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | fetal bovine serum |
| Ficoll | Cytiva | 17144002 | Ficoll Paque Plus |
| Fixation buffer | Biolegend | 420801 | Paraformaldehyde |
| HCl | Merk | 1.09057.1000 | Hydrochloric acid |
| Hoechst 33342 | Promokine | PK-CA707-40046 | Hoechst 33342 |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | Recombinant Human M-CSF |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7791-18-6 | Magnesium chloride |
| Na2HPO4 | AppliChem GmbH | A2943,0250 | di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous |
| NaCl | Merk | S7653-250G | Sodium chloride |
| NaHCO3 | Merk | K15322429 | Bicarbonate of Soda |
| PBS | Lonza | 17-512F | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium |
| Pen-Strep | Lonza | DE17-602E | Penicillin-Streptomycin Mixture |
| Phalloidin-Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 Phalloidin |
| RANKL | PeproTech | 310-01 | Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived) |
| Tris | Sigma-Aldrich | 93362 | Tris(hydroxymethyl)aminomethan |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol |
| TrypLE Express | Gibco | 12605010 | Recombinant cell-dissociation enzymes |
Referências
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