La dernière génération d’outils de caractérisation des véhicules électriques est capable d’analyser simultanément plusieurs paramètres uniques. La cytométrie en nanoflux mesure toutes les particules biologiques de plus de 45 nm sans marquage et identifie les caractéristiques spécifiques des sous-populations par diverses techniques de marquage fluorescent.
La caractérisation d’une seule particule est devenue de plus en plus pertinente pour la recherche sur les vésicules extracellulaires, passant des techniques d’analyse en vrac et de l’analyse des particules de première génération à des mesures multiparamètres complètes telles que la cytométrie en nanoflux (nFCM). La nFCM est une forme de cytométrie en flux qui utilise des instruments spécialement conçus pour l’analyse des nanoparticules, permettant de caractériser des milliers de VE par minute avec et sans l’utilisation de techniques de coloration. La détection par diffusion latérale (SS) à haute résolution permet de déterminer la taille et la concentration de toutes les particules biologiques de plus de 45 nm, tandis que la détection simultanée par fluorescence (FL) identifie la présence de marqueurs marqués et de cibles d’intérêt. Les sous-populations marquées peuvent ensuite être décrites en unités quantitatives de particules/mL ou en pourcentage du total des particules identifiées par diffusion latérale.
Ici, les VE dérivés de milieux de culture cellulaire conditionnés (CCM) sont marqués à la fois avec un colorant lipidique, pour identifier les particules avec une membrane, et des anticorps spécifiques pour CD9, CD63 et CD81 comme marqueurs EV communs. Les mesures du matériau de comparaison, une norme de concentration et une norme de taille des nanosphères de silice, ainsi que des échantillons marqués sont analysées dans une analyse de 1 minute. Le logiciel est ensuite utilisé pour mesurer la concentration et le profil de distribution granulométrique de toutes les particules, indépendamment du marquage, avant de déterminer les particules positives pour chacune des étiquettes.
La détection simultanée de SS et de FL peut être utilisée de manière flexible avec de nombreuses sources de véhicules électriques et cibles d’étiquetage différentes, externes et internes, décrivant les échantillons de véhicules électriques de manière complète et quantitative.
Que sont les véhicules électriques?
Les vésicules extracellulaires (VE) sont le terme collectif désignant une gamme de particules membraneuses dérivées de cellules faisant partie intégrante de nombreuses activités cellulaires et tissulaires normales. Leur impact sur un large éventail de domaines scientifiques et leur pertinence clinique potentielle ont entraîné une croissance de la recherche sur les véhicules électriques et de l’intérêt industriel1. La recherche sur les petits EV (sEV) se concentre principalement sur les exosomes, des particules de 40 à 100 nm qui commencent à se former dans les premiers endosomes avant la maturation et sont libérées par fusion de corps multivésiculaires (MVB) dans la membrane plasmique, ainsi que sur les microvésicules, qui bourgeonnent directement de la membrane plasmique formant des particules de 80 à 1 000 nm2. Une troisième population de VE sont des corps apoptotiques, des particules de 50 à 1 500 nm formées lors de la mort cellulaire, ce qui signifie que leur proportion relative par rapport aux autres VE peut être très variable3.
Étant donné que les caractéristiques des VE peuvent représenter des changements se produisant dans leur cellule ou tissu d’origine, il est possible de les utiliser dans les diagnostics. Diverses analyses « omiques » ont commencé à identifier des marqueurs de l’origine cellulaire et de l’état de la maladie, ce qui peut permettre une évaluation non invasive des patients utilisant des sources de VE telles que le plasma/sérum sanguin, l’urine, la salive et le liquide céphalorachidien (LCR)4,5. Une force motrice derrière ces innovations liées aux véhicules électriques sont de nouvelles techniques de caractérisation qui surmontent les limites précédentes.
La nécessité et les défis de la caractérisation des véhicules électriques uniques
La caractérisation d’un seul EV devient de plus en plus importante pour la validation et la description des isolats EV, ainsi que pour l’élucidation des caractéristiques clés de ces nanoparticules pour la progression des thérapies et des diagnostics basés sur les VE6. Selon la source de VE et l’utilisation prévue, l’analyse de la pureté, souvent décrite comme un rapport entre les particules EV et les particules non-EV ou comme EV par rapport aux protéines libres, peut nécessiter des quantités importantes de données provenant de plusieurs analyses7.
Les mesures de comptage et de dimensionnement des particules dans les publications sur les véhicules électriques reposaient auparavant fortement sur le suivi des nanoparticules (NTA), la détection d’impulsions résistives (RPS) et la microscopie électronique (EM)2. Les NTA et RPS standard n’ont pas la capacité de distinguer les VE des particules non-EV et ont leurs propres mises en garde telles que le débit lent8 et la limite inférieure de détection inappropriée observée avec NTA 9,10,11.
Les tétraspanines CD9, CD63 et CD81 ont toujours été des identificateurs importants de la présence de VE dans les isolements/préparations de VE. Généralement, les techniques de Western blot (WB) et de dot blot sont utilisées pour montrer l’enrichissement de ces protéines dans les isolats EV par rapport au lysatcellulaire 12. Cependant, le manque de quantification de ces méthodes et l’hétérogénéité de ces marqueurs EV, tant en ce qui concerne l’affichage au sein des sous-populations EV que la variation liée aux cellules, aux tissus ou aux patients, encouragent les techniques analytiques avancées, qui unifient la caractérisation physique et phénotypique13.
La cytométrie en nanoflux comme technique complète d’analyse EV
La détermination des concentrations réelles de VE nécessite l’identification de particules intactes et d’un marqueur universel, en particulier dans les isolats de particules complexes, avec une résolution capable de détecter tous les VE tout en les distinguant des particules non EV14.
La nanocytométrie en flux (nFCM) est une technique qui permet d’analyser sans marquage des particules de taille comprise entre 45 et 1 000 nm tout en utilisant simultanément le marquage fluorescent et la détection pour identifier les sous-populations de particules. Une distinction clé par rapport à la cytométrie en flux conventionnelle est l’utilisation d’équipements dédiés à l’analyse des nanoparticules, permettant la plus grande résolution15. L’analyse EV, qui utilise une instrumentation de flux conventionnelle réutilisée pour l’analyse de petites particules, s’améliore, mais a encore du mal à atteindre la résolution nécessaire pour détecter et analyser les EV <100 nm16,17. La cytométrie en flux basée sur les billes est une autre adaptation souvent utilisée pour l’analyse EV, mais elle élimine la possibilité de détection de particules uniques et introduit des biais basés sur la capture18.
Bénéficiant d’une limite inférieure de détection de ~45 nm dans le canal de diffusion latérale (SS) pour l’analyse EV, nFCM utilise le déclenchement SS. Cela peut être considéré comme une analyse « particule d’abord » car cela signifie que les événements doivent fournir un signal SS, dépassant un seuil défini avant l’analyse de l’intensité de fluorescence. Cela élimine les faux positifs tels que les agrégations de membranes dégradées et de fluorophores, et concentre l’analyse sur les VE intacts15. Les mesures SS sont également utilisées pour dimensionner des particules individuelles par rapport à une norme de nanosphère de silice à quatre modales19. Les mesures de fluorescence sont effectuées sur deux autres détecteurs permettant trois mesures simultanées pour chaque particule afin de décrire la concentration de particules, les tailles et la présence de marqueurs ou d’autres cibles d’intérêt afin d’identifier les sous-populations EV20.
Dans l’expérience suivante, des mesures SS et fluorescentes (FL) sont utilisées pour mesurer des particules de >45 nm, montrer le sous-ensemble des VE positifs sur membrane et identifier la présentation de CD9, CD63, CD81 sur les sous-populations de VE. La concentration de ces sous-populations et leur rapport par rapport au total des particules mesurées par SS sont décrits, de même que leurs profils de taille.
Détails de l’échantillon et du réactif
Deux isolats EV provenant de lignées cellulaires distinctes ont été sélectionnés pour la démonstration du marquage fluorescent et l’analyse ultérieure de la nFCM. Les deux EV ont été suspendus dans du PBS et stockés à -80 °C pendant <3 mois, mais la plupart des autres conditions étaient différentes d’un isolat. La lignée cellulaire de myoblastes de souris C2C12 représente un précurseur embryonnaire des cellules musculaires squelettiques et a été cultivée en culture 2D, conditionnant le milieu de croissance pendant 72 heures avant l’isolement de l’EV par ultracentrifugation. SW620 est une lignée cellulaire d’adénocarcinome du côlon humain et a été cultivé dans un bioréacteur rudimentaire, enrichissant les milieux pendant 7 semaines, avec isolement EV effectué par chromatographie d’exclusion de taille (SEC) et fractions 7-9 éluées à partir de colonnes de sépharose CL-2B combinées en un seul échantillon.
Bien que les VE isolés et concentrés à partir de CCM soient les types d’échantillons les plus faciles à utiliser, le nFCM s’applique à la plupart des isolats de VE, y compris les biofluides tels que le sérum, le plasma, l’urine et le LCR. Ces analyses d’échantillons bénéficient de la détection nFCM SS de toutes les particules, permettant une corroboration avec NTA, TRPS et d’autres analyses de particules, tout en décrivant les sous-populations EV marquées par fluorescence en termes quantitatifs ainsi qu’une proportion du total, pour une approche non biaisée de l’analyse multiparamétrique des particules. L’analyse d’échantillons faiblement transformés est également possible, comme l’urine non clarifiée et la CCM enrichie en EV avec la mise en garde d’exiger des protéines faiblement contaminées.
Le colorant membranaire utilisé ici est destiné à s’intégrer dans la bicouche lipidique, avec une fraction lipophile pour la charge membranaire et un colorant hydrophile pour rester dans la membrane plasmique25. Il n’existe actuellement aucun colorant d’étiquetage EV parfait et plusieurs critères doivent être pris en compte lors du choix, notamment la spécificité des VE, l’adéquation à la fixation ou à la perméabilisation et l’efficacité de l’étiquetage EV26.
Le marquage par anticorps conjugués fluorescents des épitopes exposés en surface s’est avéré une méthode efficace pour identifier les sous-populations de VE27. Un aspect clé de l’optimisation du protocole est de respecter, et non de dépasser, le point de saturation du marquage pour se lier à tous les épitopes disponibles sans inhiber la détection des particules de faible fluorescence en permettant au tampon environnant d’être rempli d’anticorps fluorescents non liés28. De plus, la disponibilité des sites de liaison exposés pour le marquage des anticorps est potentiellement influencée par plusieurs facteurs. Il a été démontré que les conditions de stockage des VE affectent les profils de concentration et de taille des VE29 , les observations indiquant également des effets sur le marquage des anticorps30. La présence de protéines corona de surface, les modifications protéiques et les impacts des techniques d’isolement peuvent également avoir des effets sur le marquage des anticorps dans certains cas. En fin de compte, à mesure que l’utilisation du marquage fluorescent deviendra plus répandue pour les études sur les véhicules électriques, la conception expérimentale et l’optimisation de multiples techniques analytiques deviendront plus raffinées.
Pour augmenter la précision des résultats, plusieurs contrôles peuvent être inclus tels que (1) PBS + contrôle colorant, pour évaluer la formation de micelle ou d’agrégats dans certains colorants, qui peuvent apparaître comme des particules SS + dans l’analyse nFCM, (2) PBS + contrôle des anticorps, des agrégats peuvent se produire, bien que souvent pas assez grands pour diffuser suffisamment de lumière pour la détection SS, (3) échantillon EV + contrôle des anticorps IgG, commun en cytométrie de flux et utilisé pour identifier toute liaison non spécifique, (4) échantillon de particules non EV + contrôle d’anticorps / colorant – particulièrement important lorsque vous devez identifier des VE dans des échantillons de particules complexes, des contrôles tels que des particules de lipoprotéines de basse densité (LDL) purifiées ou des échantillons appauvris / ablés en EV peuvent agir comme un contrôle négatif pour valider le marquage sélectif, (5) les contrôles positifs sont difficiles à concevoir, mais la validation d’un anticorps sur les cellules est une inclusion utile.
Présentation des tétraspanines sur les véhicules électriques
Le marquage des anticorps et de la membrane de cette expérience démontre le niveau élevé de données quantitatives qui peuvent être obtenues dans un court laps de temps par l’analyse nFCM. La mesure simultanée des principaux attributs physiques du diamètre/concentration des particules avec les mesures phénotypiques de la présence membranaire et/ou protéique conduit à des descriptions de haut niveau des sous-populations dans l’isolement des particules.
Il est important de noter que des niveaux variables des trois tétraspanines « clés » liées à l’EV, CD9, CD63, CD81, ont été identifiés dans ces deux échantillons de VE. CD9 a été présenté sur la plus grande proportion de VE pour les VE dérivés de C2C12 et SW620, CD81 et CD63 étant les deuxièmes et les moins présentées protéines, respectivement.
Malgré certaines similitudes observées ici dans les profils de tétraspanine des VE provenant de deux sources cellulaires très différentes, les niveaux de CD9, CD63 et CD81 peuvent être très différents entre la lignée cellulaire et les EV31 dérivés du patient.
La différence d’expression de CD63 entre les deux échantillons de VE est particulièrement pertinente pour la discussion en cours sur les identificateurs clés de « EV-ness ». Bien que la présentation de CD63 dans seulement ~8% des VE SW620 puisse être inattendue pour certains, CD63 a été suggéré comme mauvais identifiant des différents types de VE isolés par taille ou densité32, et les VE négatifs à la tétraspanine ont été identifiés, même lorsqu’ils sont décrits comme exosomes33.
Identification des VE dans des isolements de particules complexes
L’hétérogénéité des profils de tétraspanine EV, à la fois dans les VE de lignées cellulaires et les VE dérivés de patients, met en garde contre le recours à la capture des VE à base de tétraspanine et souligne le besoin futur de nouvelles méthodes d’identification des VE31. Le marquage des VE indépendant de protéines spécifiques pourrait s’avérer très bénéfique pour identifier les VE à partir de particules non EV de taille similaire si la spécificité EV peut être prouvée très élevée. Cela est particulièrement vrai pour les isolats de VE biofluide, car il a été suggéré que la concentration de VE dans le plasma sanguin humain est de l’ordre de 10 10 particules/mL, tandis que les lipoprotéines sont mesurées à10 16 par mL14,34. Même lors de l’enrichissement en EV, les études comparant la positivité des particules pour les marqueurs de tétraspanine et / ou le marqueur LDL ApoB suggèrent ~50-100 fois plus grande abondance de LDL dans les échantillons de plasma libre de plaquettes (PFP) par rapport à EV35.
La technique d’isolement utilisée affecte grandement la gamme de particules non EV co-isolées telles que les lipoprotéines de très basse densité (VLDL), les lipoprotéines de densité intermédiaire (IDL) et LDL36. Il existe également des descriptions de co-isolats de lipoprotéines liés aux VE qui, tout en jouant potentiellement un rôle biologique important, font de l’obtention d’échantillons purs de VE un objectif difficile35.
Par conséquent, on pourrait soutenir qu’il faudrait mettre davantage l’accent sur la description des particules qui composent un échantillon, plutôt que de parvenir à isoler une sélection pure mais limitée de VE. Obtenir une description complète des particules en mesurant séparément l’abondance de tétraspanine en vrac et en nombre de particules peut être insuffisant pour déterminer avec précision les concentrations de VE, en particulier à partir de sources biofluides36,37. L’identification de sous-populations dans une approche à plusieurs niveaux, montrant les particules totales, les VE et les VE présentant certaines protéines, comme démontré dans cette expérience, peut fournir une solution robuste à la caractérisation des nanoparticules. Cela a été le cas pour les projets impliquant le chargement de véhicules électriques avec des conceptions pour de futures applications thérapeutiques20 et l’identification de VE CD63+ avec une cargaison luminale telle que les mitochondries38.
nFCM dans le répertoire de l’analyse des véhicules électriques
L’une des forces de l’analyse nFCM EV est la façon dont les données peuvent corroborer et s’appuyer sur les analyses EV les plus courantes et former des ponts entre les ensembles de données physiques et phénotypiques. Cependant, cela est basé sur des protocoles de marquage précis qui doivent souvent être optimisés pour des réactifs de marquage uniques tels que les colorants et les anticorps. Un critère clé pour une analyse précise est d’avoir des particules marquées en suspension dans un tampon non fluorescent, ce qui repose soit sur l’élimination de l’excès de fluorophore non lié, soit sur le raffinement des protocoles pour ne pas dépasser la saturation des épitopes.
Des études comparatives ont montré que le dimensionnement nFCM des VE fournit des données conformes au TRPS et à la cryo-TEM, techniques décrites comme plus précises que la NTA pour l’analyse de la taille des VE10,39. Cependant, comme pour toute méthode optique, l’influence des propriétés optiques hétérogènes observées pour les VE et les différences entre les propriétés optiques du matériau de référence et des VE doivent être reconnues lors de l’interprétation des données10.
Le transfert Western a été une méthode clé pour indiquer l’enrichissement des VE par l’identification des marqueurs de VE40. Mais le désir de démontrer la présence de tels marqueurs sur les particules a conduit à des avancées dans les analyses cytométriques en flux basées sur EV17. Cependant, les résolutions nécessaires pour fournir des données robustes sont actuellement mieux atteintes par une instrumentation dédiée en ce qui concerne la lumière diffusée et fluorescente19.
nFCM fournit une approche impartiale de la description initiale de toutes les particules non pertinentes pour des marqueurs spécifiques, en utilisant la mesure de diffusion latérale, permettant une corroboration avec les techniques les plus courantes de NTA, RPS et TEM1, tout en ajoutant simultanément une mesure phénotypique similaire à WB ou Elisa de manière quantitative.
The authors have nothing to disclose.
Nous tenons à remercier les groupes d’Owen Davies et de Nick Peake pour avoir continué à fournir du matériel et de l’expertise.
APC Anti-CD81 antibody (M38) | abcam | ab233259 | Anti-Human CD81 APC conjugated antibody |
APC Anti-CD9 antibody (EM-04) | Abcam | ab82392 | Anti-mouse CD9 APC conjugated antibody |
APC Anti-CD9 antibody (MEM-61), prediluted | abcam | ab82389 | Anti-Human CD9 APC conjugated antibody |
APC anti-mouse CD63 antibody | biolegend | 143905 | Anti-Mouse CD63 APC conjugated antibody |
APC anti-mouse/rat CD81 antibody | biolegend | 104909 | Anti-Mouse CD81 APC conjugated antibody |
CD63 monoclonal antibody (MEM-259), APC | invitrogen Via Fisherscientific | A15712 | Anti-Human CD63 APC conjugated antibody |
Celline AD1000 bioreactor | Merck | Z688037-5EA | |
Cleaning solution | NanoFCM | 17159 | In house cleaning solution for nanoanalyser |
EVs from C2C12 | Gifted | Mouse line | |
EVs from SW620 | Gifted | Human line | |
Memglow – Fluorogenic Membrane Probe | Cytoskeleton | MG01 | non toxic cell membrane dye |
NanoAnalyzer | NanoFCM | nano-flow cytometer for measurement of single particles | |
PBS, pH 7.2 | Gibco Via Fisherscientific | 12549079 | Salt solution for dilution of samples and antibodies |
Snaplock Microtubes, 0.60mL | Axygen Via Fisherscientific | 11371944 | Tubes required to load sample into nanoanalyser |