Microtransplantatie van synaptische membranen om menselijke synaptische receptoren voor functionele studies te reactiveren
Summary
Het protocol toont aan dat door microtransplantatie van synaptische membranen in Xenopus laevis-eicellen uit te voeren, het mogelijk is om consistente en betrouwbare reacties van α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionzuur en γ-aminoboterzuurreceptoren vast te leggen.
Abstract
Exciterende en remmende ionotrope receptoren zijn de belangrijkste poorten van ionenfluxen die de activiteit van synapsen bepalen tijdens fysiologische neuronale communicatie. Daarom zijn veranderingen in hun overvloed, functie en relaties met andere synaptische elementen waargenomen als een belangrijke correlatie van veranderingen in de hersenfunctie en cognitieve stoornissen bij neurodegeneratieve ziekten en psychische stoornissen. Begrijpen hoe de functie van exciterende en remmende synaptische receptoren wordt veranderd door ziekte is van cruciaal belang voor de ontwikkeling van effectieve therapieën. Om ziekterelevante informatie te verkrijgen, is het belangrijk om de elektrische activiteit van neurotransmitterreceptoren vast te leggen die functioneel blijven in het zieke menselijke brein. Tot nu toe is dit de dichtstbijzijnde benadering om pathologische veranderingen in de functie van receptoren te beoordelen. In dit werk wordt een methodologie gepresenteerd om microtransplantatie van synaptische membranen uit te voeren, die bestaat uit het reactiveren van synaptische membranen uit snap bevroren menselijk hersenweefsel met menselijke receptoren, door de injectie en posterieure fusie in het membraan van Xenopus laevis-eicellen . Het protocol biedt ook de methodologische strategie om consistente en betrouwbare reacties van α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionzuur (AMPA) en γ-aminoboterzuur (GABA) receptoren te verkrijgen, evenals nieuwe gedetailleerde methoden die worden gebruikt voor normalisatie en rigoureuze gegevensanalyse.
Introduction
Neurodegeneratieve aandoeningen treffen een groot percentage van de bevolking. Hoewel hun verwoestende gevolgen bekend zijn, is het verband tussen de functionele veranderingen van neurotransmitterreceptoren, die van cruciaal belang zijn voor de hersenfunctie, en hun symptomatologie nog steeds slecht begrepen. Interindividuele variabiliteit, chronische aard van de ziekte en sluipenderwijs begin van symptomen zijn slechts enkele van de redenen die het begrip van de vele hersenaandoeningen hebben vertraagd waarbij chemische onevenwichtigheden goed gedocumenteerd zijn 1,2. Diermodellen hebben waardevolle informatie gegenereerd en onze kennis uitgebreid over de mechanismen die ten grondslag liggen aan fysiologie en pathofysiologie in evolutionair geconserveerde systemen; verschillende interspecies verschillen tussen knaagdieren en mensen verhinderen echter de directe extrapolatie van receptorfunctie van diermodellen naar het menselijk brein3. Zo werden de eerste inspanningen om inheemse menselijke receptoren te bestuderen ontwikkeld door het laboratorium van Ricardo Miledi met behulp van chirurgisch verwijderd weefsel en bevroren monsters. Deze eerste experimenten gebruikten hele membranen die neuronale synaptische en extra synaptische receptoren omvatten, evenals niet-neuronale neurotransmitterreceptoren, en hoewel ze belangrijke informatie over zieke toestanden bieden, is er bezorgdheid dat de mix van receptoren de interpretatie van gegevens bemoeilijkt 4,5,6,7. Belangrijk is dat synapsen het belangrijkste doelwit zijn bij veel neurodegeneratieve aandoeningen 8,9; daarom zijn testen om de functionele eigenschappen van aangetaste synapsen te testen van fundamenteel belang om informatie te verkrijgen over ziekterelevante veranderingen die de synaptische communicatie beïnvloeden. Hier wordt een wijziging van de oorspronkelijke methode beschreven: microtransplantatie van synaptische membranen (MSM), die zich richt op de fysiologische karakterisering van verrijkte synaptische eiwitpreparaten en met succes is toegepast om ratten en menselijke synaptosomen te bestuderen 10,11,12,13,14,15 . Met deze methodologie is het mogelijk om synaptische receptoren te transplanteren die ooit in het menselijk brein werkten, ingebed in hun eigen inheemse lipiden en met hun eigen cohort van geassocieerde eiwitten. Omdat MSM-gegevens kwantitatief zijn, is het bovendien mogelijk om deze gegevens te gebruiken om te integreren met grote proteomische of sequencinggegevenssets10.
Het is belangrijk op te merken dat veel farmacologische en biofysische analyses van synaptische receptoren worden uitgevoerd op recombinante eiwitten 16,17. Hoewel deze benadering beter inzicht biedt in de structuur-functierelaties van receptoren, kan het geen informatie geven over complexe multimere receptorcomplexen in neuronen en hun veranderingen in ziekte. Daarom moet een combinatie van inheemse en recombinante eiwitten een uitgebreidere analyse van synaptische receptoren opleveren.
Er zijn veel methoden om synaptosomen 10,11,12,13,14,15 te bereiden die kunnen worden aangepast aan de vereisten van een laboratorium. Het protocol begint met de veronderstelling dat synaptosomaal verrijkte preparaten werden geïsoleerd en klaar zijn om te worden verwerkt voor microtransplantatie-experimenten. In het laboratorium wordt de Syn-Per-methode gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. Dit wordt gedaan vanwege de hoge reproduceerbaarheid in elektrofysiologische experimenten10,11. Er is ook overvloedige literatuur die uitlegt hoe Xenopus-eicellen 18,19 kunnen worden geïsoleerd, die ook klaar voor injectie kunnen worden gekocht20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analyse van inheemse eiwitcomplexen uit menselijke hersenen is nodig om homeostatische en pathologische processen bij hersenaandoeningen te begrijpen en therapeutische strategieën te ontwikkelen om ziekten te voorkomen of te behandelen. Hersenbanken met snap frozen monsters zijn dus een onschatbare bron van een grote en meestal onaangeboorde schat aan fysiologische informatie29,30. Een eerste zorg voor het gebruik van postmortaal weefsel is de duidelijke mogelij…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIA/NIH subsidies R01AG070255 en R01AG073133 aan AL. We bedanken ook het onderzoekscentrum voor de ziekte van Alzheimer van de Universiteit van Californië (UCI-ADRC) voor het verstrekken van het menselijke weefsel dat in dit manuscript wordt getoond. De UCI-ADRC wordt gefinancierd door NIH / NIA-subsidie P30 AG066519.
Materials
| For Microinjection | |||
| 3.5" Glass Capillaries | Drummond | 3-000-203-G/X | |
| 24 well, flat bottom Tissue Culture Plate | Thermofisher | FB012929 | |
| Flaming/Brown type micropipette puller | Sutter | P-1000 | |
| Injection Dish | Thermofisher | 08-772B | |
| Microcentrifuge Tubes | Thermofisher | 02-682-002 | |
| Mineral Oil | Thermofisher | O121-1 | |
| Nanoject II | Drummond | 3-000-204 | |
| Nylon mesh | Industrial Netting | WN0800 | |
| Parafilm | Thermofisher | S37440 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Syringe | Thermofisher | 14-841-31 | |
| Ultrasonic cleaning bath | Thermofisher | FS20D | |
| Xenopus laevis frogs | Xenopus 1 | 4217 | |
| For Two Electrode Voltage clamp | |||
| 15 cm long fire polished borosilicate glass capillaries | Sutter | B200-116-15 | |
| Any PC computer or laptop | |||
| Low-pass Bessel Filter | Warner Instruments | LPF-8 | |
| Stereoscope | Fisher Scientific | 03-000-037 | |
| Two electrode voltage clamp workstation | Warner Instruments | TEV-700 | |
| ValveLink 8.2 Perfusion Controller | Automate Scientific | SKU:01-18 | |
| WInEDR Free software | University of Strathclyde Glasgow | https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm | |
| X Series Multifunction DAQ | National Instruments | NI USB-6341 | |
| Reagents | |||
| Calcium dichloride | Thermofisher | C79 | |
| Calcium nitrate tetrahydrate | Thermofisher | C109 | |
| Collagenase | Sigma-Aldrich | C0130 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Thermofisher | BP310 | |
| Kainic acid | Tocris | 0222 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Thermofisher | M63 | |
| Potassium chloride | Thermofisher | P217 | |
| Sodium bicarbonate | Thermofisher | S233 | |
| Sodium chloride | Thermofisher | S271-1 | |
| Ultrafree-0.1 µm MC filter, | Amicon |
Referências
- Furcila, D., Defelipe, J., Alonso-Nanclares, L. A study of amyloid-β and phosphotau in plaques and neurons in the hippocampus of Alzheimer’s disease patients. Journal of Alzheimer’s Disease. 64 (2), 417-435 (2018).
- Varol, E., Sotiras, A., Davatzikos, C. HYDRA: revealing Heterogeneity of imaging and genetic patterns through a multiple max-margin discriminative analysis framework. Neuroimaje. 145, 346-364 (2017).
- Hodge, R. v. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
- Wu, J., et al. GABAA receptor-mediated excitation in dissociated neurons from human hypothalamic hamartomas. Experimental Neurology. 213 (2), 397-404 (2008).
- Miledi, R., Eusebi, F., Martínez-Torres, A., Palma, E., Trettel, F. Expression of functional neurotransmitter receptors in Xenopus oocytes after injection of human brain membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (20), 13238-13242 (2002).
- Zwart, R., Mazzo, F., Sher, E. Microtransplantation of human brain receptors into oocytes to tackle key questions in drug discovery. Drug Discovery Today. 24 (2), 533-543 (2019).
- Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Miledi, R. Microtransplantation of neurotransmitter receptors from postmortem autistic brains to Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (31), 10973-10977 (2008).
- Bae, J. R., Kim, S. H. Synapses in neurodegenerative diseases. BMB Reports. 50 (5), 237-246 (2017).
- Taoufik, E., Kouroupi, G., Zygogianni, O., Matsas, R. Synaptic dysfunction in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases: An overview of induced pluripotent stem-cell-based disease models. Open Biology. 8 (9), 180138 (2018).
- Zeppillo, T., et al. Functional impairment of cortical AMPA receptors in schizophrenia. Schizophrenia Research. , (2020).
- Lauterborn, J. C., et al. Increased excitatory to inhibitory synaptic ratio in parietal cortex samples from individuals with Alzheimer’s disease. Nature Communications. 12 (1), 2603 (2021).
- Mazzo, F., et al. Reconstitution of synaptic Ion channels from rodent and human brain in Xenopus oocytes: a biochemical and electrophysiological characterization. Journal of Neurochemistry. 138 (3), 384-396 (2016).
- Sanna, E., et al. Expression of native GABA(A) receptors in Xenopus oocytes injected with rat brain synaptosomes. Journal of Neurochemistry. 67 (5), 2212-2214 (1996).
- Sanna, E., et al. Functional changes in rat nigral GABA(A) receptors induced by degeneration of the striatonigral GABAergic pathway: An electrophysiological study of receptors incorporated into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 70 (6), 2539-2544 (1998).
- Sandoval, M., et al. Antagonistic effects of TrkB and p75NTR on NMDA receptor currents in post-synaptic densities transplanted into Xenopus oocytes. Journal of Neurochemistry. 101 (6), 1672-1684 (2007).
- Perrais, D., Pinheiro, P. S., Jane, D. E., Mulle, C. Antagonism of recombinant and native GluK3-containing kainate receptors. Neuropharmacology. 56 (1), 131-140 (2009).
- Zhao, Y., Chen, S., Swensen, A. C., Qian, W. J., Gouaux, E. Architecture and subunit arrangement of native AMPA receptors elucidated by cryo-EM. Science. 364 (6438), 355-362 (2019).
- Bröer, S. Xenopus laevis Oocytes. Membrane Transporters in Drug Discovery and Development: Methods and Protocols. , 295-310 (2010).
- Newman, K., Aguero, T., King, M. Lou Isolation of xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2018 (2), 86-91 (2018).
- Lin-Moshier, Y., Marchant, J. S. The Xenopus oocyte: A single-cell model for studying Ca2+ signaling. Cold Spring Harbor Protocols. 8 (3), 185-191 (2013).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Microinjection of Xenopus oocytes. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
- Eusebi, F., Palma, E., Amici, M., Miledi, R. Microtransplantation of ligand-gated receptor-channels from fresh or frozen nervous tissue into Xenopus oocytes: A potent tool for expanding functional information. Progress in Neurobiology. 88 (1), 32-40 (2009).
- Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (11), 5224-5228 (1995).
- Cutting, G. R., et al. Cloning of the γ-aminobutyric acid (GABA) ρ1 cDNA: A GABA receptor subunit highly expressed in the retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (7), 2673-2677 (1991).
- Calvo, D. J., Vazquez, A. E., Miledi, R. Cationic modulation of ρ1-type γ-aminobutyrate receptors expressed in Xenopus oocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (26), 12725-12729 (1994).
- Martínez-Torres, A., Miledi, R. Expression of γ-aminobutyric acid ρ1 and ρ1Δ450 as gene fusions with the green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (4), 1947-1951 (2001).
- Ochoa-De La Paz, L. D., Estrada-Mondragón, A., Limón, A., Miledi, R., Martínez-Torres, A. Dopamine and serotonin modulate human GABAρ1 receptors expressed in Xenopus laevis oocytes. ACS Chemical Neuroscience. 3 (2), 96-104 (2012).
- Limon, A., Reyes-Ruiz, J. M., Eusebi, F., Miledi, R. Properties of GluR3 receptors tagged with GFP at the amino or carboxyl terminus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (39), 15526-15530 (2007).
- C, S. N. A Rosetta stone for analysis of human membrane protein function. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (31), 10641-10642 (2008).
- Eleonora, P., et al. GABAA-current rundown of temporal lobe epilepsy is associated with repetitive activation of GABAA "phasic" receptors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (52), 20944-20948 (2007).
- Bond, B. C., et al. The quantification of gene expression in an animal model of brain ischaemia using TaqManTM real-time RT-PCR. Molecular Brain Research. 106 (1-2), 101-116 (2002).
- Preece, P., Cairns, N. J. Quantifying mRNA in postmortem human brain: influence of gender, age at death, postmortem interval, brain pH, agonal state and inter-lobe mRNA variance. Molecular Brain Research. 118 (1-2), 60-71 (2003).
- Preece, P., et al. An optimistic view for quantifying mRNA in post-mortem human brain. Molecular Brain Research. 116 (1-2), 7-16 (2003).
- Stan, A. D., et al. Human postmortem tissue: What quality markers matter. Brain Research. 1123 (1), 1-11 (2006).
- Scaduto, P., Sequeira, A., Vawter, M. P., Bunney, W., Limon, A. Preservation of global synaptic excitatory to inhibitory ratio during long postmortem intervals. Scientific Reports. 10 (1), 1-8 (2020).
- Marsal, J., Tigyi, G., Miledi, R. Incorporation of acetylcholine receptors and Cl- channels in Xenopus oocytes injected with Torpedo electroplaque membranes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (11), 5224-5228 (1995).
- Le Mauff, A., et al. Nicotinic acetylcholine receptors in the synganglion of the tick Ixodes ricinus: Functional characterization using membrane microtransplantation. International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. 14, 144-151 (2020).
- Crespin, L., Legros, C., List, O., Tricoire-Leignel, H., Mattei, C. Injection of insect membrane in Xenopus oocyte: An original method for the pharmacological characterization of neonicotinoid insecticides. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 77, 10-16 (2016).
- Soualah, Z., et al. GABAA Receptor Subunit Composition Drives Its Sensitivity to the Insecticide Fipronil. Frontiers in Neuroscience. 15, 1-13 (2021).
- Symington, S. B., Murenzi, E., Toltin, A. C., Lansky, D., Clark, J. M. Realizing the potential: improving a microtransplantation assay based on neurolemma-injected Xenopus oocytes: an ex vivo approach to study ion channels in their native state. ACS Symposium Series. 1264, 53-73 (2017).
- Palma, E., et al. Microtransplantation of membranes from cultured cells to Xenopus oocytes: A method to study neurotransmitter receptors embedded in native lipids. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2896-2900 (2003).
