Xenograft hudmodell för att manipulera mänskliga immunsvar in vivo
Summary
Detta protokoll beskriver hur man ympar mänsklig hud på icke-överviktiga diabetiker (NOD) -scid interleukin-2 gamma chain receptor (NSG) möss. En detaljerad beskrivning av beredningen av mänsklig hud för transplantation, förberedelse av möss för transplantation, transplantation av mänsklig hud med delad tjocklek och återhämtningsförfarande efter transplantation ingår i rapporten.
Abstract
Den mänskliga hudxenograftmodellen, där mänsklig donatorhud transplanteras på en immunbristmusvärd, är ett viktigt alternativ för translationell forskning inom hudimmunologi. Murin och mänsklig hud skiljer sig väsentligt i anatomi och immuncellsammansättning. Därför har traditionella musmodeller begränsningar för dermatologisk forskning och läkemedelsupptäckt. Framgångsrika xenotransplanter är dock tekniskt utmanande och kräver optimal förberedelse av prov- och mustransplantatplats för transplantat och värdöverlevnad. Detta protokoll tillhandahåller en optimerad teknik för att transplantera mänsklig hud på möss och diskuterar nödvändiga överväganden för nedströms experimentella mål. Denna rapport beskriver lämplig beredning av ett humant donatorhudprov, montering av en kirurgisk installation, förberedelse av mus och kirurgisk plats, hudtransplantation och postkirurgisk övervakning. Anslutning till dessa metoder möjliggör underhåll av xenografter i över 6 veckor efter operationen. De tekniker som beskrivs nedan möjliggör maximal ympningseffektivitet på grund av utvecklingen av tekniska kontroller, steril teknik och pre- och postkirurgisk konditionering. Lämplig prestanda för xenograftmodellen resulterar i långlivade humana hudtransplantatprover för experimentell karakterisering av mänsklig hud och preklinisk testning av föreningar in vivo.
Introduction
Musmodeller används ofta för att dra slutsatser om mänsklig biologi och sjukdom, delvis på grund av deras experimentella reproducerbarhet och förmåga till genetisk manipulation. Musfysiologi rekapitulerar dock inte helt mänskliga organsystem, särskilt hud, och har därför begränsningar för användning som preklinisk modell vid läkemedelsutveckling1. Anatomiska skillnader mellan mus och mänsklig hud inkluderar skillnader i epiteltjocklekar och arkitektur, brist på murina ekkrina svettkörtlar och variationer i hårcykling2. Dessutom skiljer sig både immunsystemets medfödda och adaptiva armar mellan de två arterna3. Mushud innehåller en unik immunpopulation av dendritiska epidermala T-celler (DETC), har ett högre överflöd av dermala γδ T-celler och varierar i immuncelldelmängd lokalisering jämfört med mänsklig vävnad4. Därför drar experimentella fynd om mänsklig hudbiologi och inflammation nytta av validering med mänsklig vävnad. Medan in vitro – och organoidodlingssystem är allmänt använda verktyg för att studera mänsklig vävnad, är dessa system begränsade av frånvarande eller ofullständig immunrekonstitution och brist på anslutning till perifer vaskulatur5. Den humaniserade xenograft-hudtransplantationsmodellen syftar till att möjliggöra terapeutisk eller biologisk manipulation av immun- och icke-immunvägar i mänskliga vävnader in vivo.
Den mänskliga hudxenograftmodellen har använts för att studera hudfysiologi och farmakologi, analysera immunavstötning och svar, dissekera mänskliga hudcancermekanismer och förstå hudsjukdomar och sårläkning6. Även om den är tillämplig på flera områden av hudforskning, har xenograftmodellen lägre genomströmning än in vitro-studier och saknar den lätthet av genetisk manipulation som används i musmodeller. Tidpunkter inom denna modell kan variera från veckor till månader, och framgångsrik ympning kräver lämpliga anläggningar och utrustning för att utföra dessa operationer. Xenograftmodellen levererar emellertid biologiskt och fysiologiskt sammanhang till experiment, medan organoidodlingssystem, såsom vävnadsutplanteringar, ofta kräver replikering av en myriad av rörliga delar, såsom exogena signaler, vid specifika tidsintervall7. Därför används denna modell bäst för att ytterligare validera fynd som observerats in vitro och inom musmodeller, eller för arbete som annars inte är biologiskt genomförbart. Lämplig användning av xenograftmodellen ger en unik möjlighet att studera och manipulera intakt mänsklig vävnad in vivo.
Optimering av xenograft hudtransplantationsmodell har förlitat sig på årtionden av forskning för att bevara transplantatintegriteten över tid. Avgörande för denna process är att använda den icke-överviktiga diabetiska (NOD) -scid interleukin-2 gamma chain receptor (NSG) musen, som saknar B- och T-adaptiva immunceller, funktionella NK-celler och har brister i makrofag och dendritiska celler8. Den immunbristiga naturen hos dessa NSG-värdar möjliggör transplantation av humana hematopoetiska celler, patient-härledda cancerformer och hud 8,9,10. Trots denna immunsuppressiva värdmiljö är ytterligare undertryckande av musens neutrofila immunsvar genom administrering av anti-GR1 nödvändig för transplantatframgång10. De viktigaste hindren vid transplantation av intakt vävnad är infektion, avstötning och svårigheter att återupprätta blodflödet till transplantatet, vilket ibland leder till förlust av dermal och epidermal integritet11. Tekniker inklusive administrering av anti-FR1 och användning av lämpligt transplantatdjup förbättrartransplantatöverlevnaden 10. Noggrann optimering gör det möjligt att utföra mänskliga xenografthudtransplantationer på NSG-möss med hög effektivitet och överlevnad, från 90% -100%.
Protocol
Representative Results
Discussion
Musxenograft-hudtransplantationsmodellen är en nyckelteknik för att mekanistiskt dissekera människors immunsvar i en in vivo-inställning 14. Framgångsrika hudxenografttransplantationer är beroende av lämplig beredning av möss och hudprover och möss och vidhäftning till aseptiska gnagarkirurgimetoder15. Snabb kylning och korrekt förvaring av hudprover vid kalla temperaturer i media (t.ex. steril saltlösning) är viktigt för att säkerställa fortsatt v?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades delvis av sponsrade forskningsavtal från TRex Bio och bidrag från NIH (1R01AR075864-01A1). JMM stöds av Cancer Research Society (bidrag 26005). Vi erkänner Parnassus Flow Cytometry Core som delvis stöds av bidrag NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 och S10 1S10OD018040-01.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
Referências
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).
- Sun, H., Zhang, Y. -. X., Li, Y. -. M. Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).
- Cristóbal, L., et al. Mouse models for human skin transplantation: a systematic review. Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Meraz, I. M., et al. An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses. Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).
- Gokkaya, A., et al. Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP). Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).
- . The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes Available from: https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA (2021)
- Rodriguez, R. S., et al. Memory regulatory T cells reside in human skin. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in rodent aseptic surgery. Current Protocols in Immunology. 82 (1), 12-14 (2008).
- Karim, A. S., et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype. PloS One. 7 (8), 44219 (2012).
- Souci, L., Denesvre, C. 3D skin models in domestic animals. Veterinary Research. 52 (1), 21 (2021).
- Holtkamp, S. J., et al. Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).
