İnsan Bağışıklık Tepkilerini In Vivo'da Manipüle Etmek için Ksenograft Cilt Modeli
Summary
Mevcut protokol, insan derisinin obez olmayan diyabetik (NOD)-scid interlökin-2 gama zinciri reseptörü (NSG) farelere nasıl aşılanacağını açıklamaktadır. Nakil için insan derisinin hazırlanması, nakil için farelerin hazırlanması, bölünmüş kalınlıkta insan derisinin nakli ve nakil sonrası iyileşme prosedürünün ayrıntılı bir açıklaması raporda yer almaktadır.
Abstract
İnsan donör derisinin immün yetmezlikli bir fare konağına nakledildiği insan derisi ksenograft modeli, cilt immünolojisinde translasyonel araştırmalar için önemli bir seçenektir. Murin ve insan derisi anatomi ve bağışıklık hücresi kompozisyonunda önemli ölçüde farklılık gösterir. Bu nedenle, geleneksel fare modellerinin dermatolojik araştırma ve ilaç keşfi için sınırlamaları vardır. Bununla birlikte, başarılı ksenotransplantasyonlar teknik olarak zordur ve greft ve konakçı sağkalımı için optimal numune ve fare greft bölgesi hazırlığı gerektirir. Mevcut protokol, insan derisinin farelere nakli için optimize edilmiş bir teknik sağlar ve aşağı akış deneysel amaçları için gerekli hususları tartışır. Bu rapor, bir insan donör cilt örneğinin uygun şekilde hazırlanmasını, cerrahi bir kurulumun montajını, fare ve cerrahi alan hazırlığını, cilt naklini ve cerrahi sonrası izlemeyi açıklamaktadır. Bu yöntemlere bağlılık, ksenogreftlerin ameliyat sonrası 6 haftadan fazla bir süre boyunca sürdürülmesini sağlar. Aşağıda özetlenen teknikler, mühendislik kontrollerinin, steril tekniğin ve ameliyat öncesi ve sonrası şartlandırmanın geliştirilmesi nedeniyle maksimum aşılama verimliliğine izin vermektedir. Ksenograft modelinin uygun performansı, insan derisinin deneysel karakterizasyonu ve bileşiklerin in vivo klinik öncesi testleri için uzun ömürlü insan derisi greft örnekleri ile sonuçlanır.
Introduction
Fare modelleri, kısmen deneysel tekrarlanabilirlikleri ve genetik manipülasyon kapasiteleri nedeniyle, insan biyolojisi ve hastalığı hakkında çıkarımlar yapmak için sıklıkla kullanılır. Bununla birlikte, fare fizyolojisi insan organ sistemlerini, özellikle cildi tamamen özetlemez ve bu nedenle ilaç geliştirmede klinik öncesi bir model olarak kullanım sınırlamaları vardır1. Fare ve insan derisi arasındaki anatomik farklılıklar arasında epitel kalınlıkları ve mimarisindeki farklılıklar, murin ekrin ter bezlerinin eksikliği ve saç döngüsündeki farklılıklarbulunur 2. Ayrıca, bağışıklık sisteminin hem doğuştan gelen hem de adaptif kolları iki tür arasında farklıdır3. Fare derisi, dendritik epidermal T hücrelerinin (DETC’ler) benzersiz bir bağışıklık popülasyonunu içerir, daha yüksek miktarda dermal γδ T hücresine sahiptir ve insan dokusuna kıyasla bağışıklık hücresi alt kümesi lokalizasyonunda değişir4. Bu nedenle, insan derisi biyolojisi ve inflamasyonu ile ilgili deneysel bulgular, insan dokusu ile doğrulamadan yararlanmaktadır. İn vitro ve organoid kültür sistemleri insan dokusunu incelemek için yaygın olarak kullanılan araçlar olsa da, bu sistemler eksik veya eksik immün rekonstrüksiyon ve periferik vaskülatür5 ile bağlantı eksikliği ile sınırlıdır. İnsanlaştırılmış ksenograft deri nakli modeli, insan dokularındaki immün ve immün olmayan yolakların in vivo olarak terapötik veya biyolojik manipülasyonuna izin vermeyi amaçlamaktadır.
İnsan derisi ksenograft modeli, cilt fizyolojisi ve farmakolojisini incelemek, bağışıklık reddini ve yanıtlarını analiz etmek, insan derisi kanseri mekanizmalarını incelemek ve cilt hastalıklarını ve yara iyileşmesini anlamak için kullanılmıştır6. Cilt araştırmasının birden fazla alanına uygulanabilir olsa da, ksenogreft modeli, in vitro çalışmalardan daha düşük verime sahiptir ve fare modellerinde kullanılan genetik manipülasyon kolaylığından yoksundur. Bu modeldeki zaman noktaları haftalardan aylara kadar değişebilir ve başarılı aşılama, bu ameliyatları gerçekleştirmek için uygun tesis ve ekipman gerektirir. Bununla birlikte, ksenograft modeli deneylere biyolojik ve fizyolojik bağlam sağlarken, doku eksplantları gibi organoid kültür sistemleri genellikle belirli zaman aralıklarında eksojen sinyaller gibi sayısız hareketli parçanın çoğaltılmasını gerektirir7. Bu nedenle, bu model en iyi şekilde in vitro ve fare modellerinde gözlemlenen bulguları daha da doğrulamak veya biyolojik olarak mümkün olmayan işler için kullanılır. Ksenograft modelinin uygun kullanımı, bozulmamış insan dokusunu in vivo olarak incelemek ve manipüle etmek için eşsiz bir fırsat sağlar.
Ksenograft cilt nakli modelinin optimizasyonu, zaman içinde greft bütünlüğünü korumak için onlarca yıllık araştırmalara dayanmaktadır. Bu süreç için kritik olan, B ve T adaptif bağışıklık hücrelerinden, fonksiyonel NK hücrelerinden yoksun olan ve makrofaj ve dendritik hücrelerde eksiklikleri olan obez olmayan diyabetik (NOD)-scid interlökin-2 gama zinciri reseptörü (NSG) faresini kullanmaktır8. Bu NSG konakçılarının immün yetmezlikli doğası, insan hematopoetik hücrelerinin, hasta kaynaklı kanserlerin ve cildin 8,9,10 transplantasyonuna izin verir. Bu immünsüpresif konakçı ortama rağmen, anti-GR1 uygulaması ile fare nötrofilik immün yanıtlarının daha fazla baskılanması greft başarısı için gereklidir10. Sağlam doku naklinde başlıca engeller enfeksiyon, reddetme ve greftten kan akışını yeniden kurmada zorluktur, bazen dermal ve epidermal bütünlüğün kaybına yol açar11. Anti-FR1 uygulaması ve uygun greft derinliğinin kullanımını içeren teknikler greft sağkalımını iyileştirir10. Titiz optimizasyon, NSG fareleri üzerinde% 90 ila% 100 arasında değişen yüksek verimlilik ve hayatta kalma oranları ile insan ksenograft cilt nakillerinin gerçekleştirilmesini mümkün kılar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fare ksenograft cilt nakli modeli, insan derisi bağışıklık tepkilerini in vivo bir ortamda mekanik olarak incelemek için anahtar bir tekniktir14. Başarılı deri ksenogreft nakilleri, farelerin ve cilt örneklerinin ve farelerin uygun şekilde hazırlanmasına ve aseptik kemirgen cerrahisi yöntemlerine uyulmasına bağlıdır15. Hızlı soğutma ve cilt örneklerinin soğuk sıcaklıklarda (steril salin gibi) uygun şekilde depolanması, nakil öncesi doku …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen TRex Bio’nun sponsorlu araştırma anlaşmaları ve NIH’den (1R01AR075864-01A1) gelen hibelerle finanse edilmiştir. JMM, Kanser Araştırma Derneği tarafından desteklenmektedir (hibe 26005). Parnassus Flow Cytometry Core’un kısmen NIH P30 DK063720, S10 1S10OD021822-01 ve S10 1S10OD018040-01 hibeleriyle desteklendiğini kabul ediyoruz.
Materials
| 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | SF100-20 | Fixative for histology |
| 3M Vetbond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB | surgical glue |
| Alexa 700 CD45 monoclonal antibody (Clone 30F11) | Thermo Fischer | 56-0451-82 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Anti-GR1 clone RB6-8C5 | BioXcell | BE0075 | Anti-rejection |
| APC mouse anti-human CD25 (Clone 2A3) | BD Biosciences | 340939 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| APC-eFluor 780 anti-human HLA-DR (Clone LN3) | eBioscience | 47-9956-42 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Autoclave pouches | VWR | 89140-800 | For autoclaving tools and paper towels |
| Brilliant Violet 60 anti-human CD4 antibody (Clone OKT4 | Biolegend | 317438 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 65 anti-human CD8a antibody (Clone RPA-T8) | Biolegend | 301042 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Brilliant Violet 711 anti-human CD3 antibody (Clone OKT3) | Biolegend | 317328 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Buprenex 0.3 mg/mL | Covetrus | 059122 | Analgesia |
| Carprofen 50 mg/mL | Zoetis | NADA # 141-199 | Analgesia |
| Collagenase Type IV | Worthington | 4188 | Skin digestion |
| D42 Dermatome blade | Humeca | 5.D42BL10 | dermatome (1 blade per sample) |
| Dermatome D42 | Humeca | 4.D42 | dermatome |
| Disposable Scalpel | Bard-Parker | 371610 | skin preparation |
| Dissecting T-Pins; 1-1/2 inch, 1000/CS 1.5 | Cole-Parmer | UX-10915-03 | To pin skin specimen for dermatome |
| Dissection scissors | medicon | 02.04.10 | sample preparation and mouse dissection |
| DNAse | Sigma-Aldrich | DN25-1G | Skin digestion |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent | eBioscience | 00-5521-00 | Flow cytometry analysis: Cell Fixation and Permeabilization |
| eFluor-450 FOXP3 monoclonal antibody (Clone PCH101) | eBioscience | 48-4776-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Electric clippers | Kent | CL8787-KIT | hair removal |
| Epredia Shandon Instant Eosin | Fisher Scientific | 6765040 | H&E |
| Epredia Shandon Instant Hematoxylin | Fisher Scientific | 6765015 | H&E |
| FITC anti-human CD45 (Clone HI30) | Tonbo Biosciences | 35-0459-T100 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| Forceps | medicon | 07.60.07 | sample preparation and mouse dissection |
| Gauze | Fisherbrand | 22-362-178 | Sample preparation |
| Heating lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Post-surgical care |
| Heating pads 4" x 10" | Pristech | 20415 | Surgical heat supply |
| Insulin 1cc 12.7 mm syringes | BD | 329410 | drug administration |
| Isoflurane | United States Pharmacopeia (USP) | NDC 66794-013-25 | Anesthesia |
| Isoflurane machine | VetEquip | 911103 | Anesthesia |
| Nair for Men | Nair | 10022600588556 | hair removal |
| Neomycin and Polymyxin Bisulfates and Bacitracin Zinc Ophthalmic ointment | Dechra | NDC 17478-235-35 | eye ointment to prevent drying |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice | The Jackson Laboratory | 005557 | Mice |
| Paper towels | Kleenex | 100848 | May be autoclaved for sterile surfaces |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | Semitransparent sealing film |
| PE mouse anti-human CD127 (Clone HIL-7R-M21) | BD Biosciences | 557938 | Flow cytometry analysis: Surface protein staining |
| PE-Cy-7 mouse anti-Ki-67 (Clone B56) | BD Biosciences | 561283 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| PerCP-eFluor-710 CD152 (CTLA-4) monoclonal antibody (Clone 14D3) | eBioscience | 46-1529-42 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining |
| Permeabilization Buffer 10x | eBioscience | 00-8333-56 | Flow cytometry analysis: Intracellular protein staining buffer |
| Petri Dish 150 mm | Corning | 430597 | Sample storage |
| Plastic Wrap | Fisherbrand | 22-305-654 | Site preparation |
| Providone-Iodine Swab stick | PDI | S41350 | Site sterilization |
| Soft-Feed and Oral Hydration (Napa Nectar) | Se Lab Group Inc | NC9066511 | For supplementing poorly recovering mice post-surgery |
| Specimen Collection Cups | Fisher Scientific | 22-150-266 | sample storage |
| Sterile alcohol prep pad | Fisherbrand | 22-363-750 | skin preparation |
| Sterile PBS | Gibco | 14190-144 | Media for sample storage |
| Sterile saline | Hospira | NDC 0409-4888-02 | For drug dilution |
| Tegaderm Film 4” x 43/4” | 3M | 1626 | transparent film wound dressing |
| Vaseline Petrolatum Gauze 3” x 8” | Kendall | 414600 | wound dressing |
| Violet 510 Ghost Dye | Tonbo Biosciences | 13-0870-T100 | Flow cytometry analysis: Viability dye |
Referências
- Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. Journal of Dermatological Science. 90 (1), 3-12 (2018).
- Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2011, 969618 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. W. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- Pasparakis, M., Haase, I., Nestle, F. O. Mechanisms regulating skin immunity and inflammation. Nature Reviews Immunology. 14 (5), 289-301 (2014).
- Sun, H., Zhang, Y. -. X., Li, Y. -. M. Generation of skin organoids: potential opportunities and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 3176 (2021).
- Cristóbal, L., et al. Mouse models for human skin transplantation: a systematic review. Cells Tissues Organs. 210 (4), 250-259 (2021).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Ito, M., et al. NOD/SCID/γcnull mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
- Meraz, I. M., et al. An improved patient-derived xenograft humanized mouse model for evaluation of lung cancer immune responses. Cancer Immunology Research. 7 (8), 1267-1279 (2019).
- Racki, W. J., et al. NOD-scid IL2rgamma(null) mouse model of human skin transplantation and allograft rejection. Transplantation. 89 (5), 527-536 (2010).
- Meehan, G. R., et al. Developing a xenograft model of human vasculature in the mouse ear pinna. Scientific Reports. 10 (1), 2058 (2020).
- Gokkaya, A., et al. Skin graft storage in platelet rich plasma (PRP). Dermatologic Therapy. 33 (1), 13178 (2020).
- . The Humeca D42 and D80 battery operated cordless dermatomes Available from: https://www.youtube.com/watch?v=YCRowX-TdA (2021)
- Rodriguez, R. S., et al. Memory regulatory T cells reside in human skin. The Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1027-1036 (2014).
- Hoogstraten-Miller, S. L., Brown, P. A. Techniques in rodent aseptic surgery. Current Protocols in Immunology. 82 (1), 12-14 (2008).
- Karim, A. S., et al. Evolution of ischemia and neovascularization in a murine model of full thickness human wound healing. Wound Repair and Regeneration: Official Publication of the Wound Healing Society [and] the European Tissue Repair Society. 28 (6), 812-822 (2020).
- Ali, N., et al. Xenogeneic graft-versus-host-disease in NOD-scid IL-2Rγnull mice display a T-effector memory phenotype. PloS One. 7 (8), 44219 (2012).
- Souci, L., Denesvre, C. 3D skin models in domestic animals. Veterinary Research. 52 (1), 21 (2021).
- Holtkamp, S. J., et al. Circadian clocks guide dendritic cells into skin lymphatics. Nature Immunology. 22 (11), 1375-1381 (2021).
