Анализ сердечной сократительной дисфункции и транзиторов Ca2+ в миоцитах грызунов

Summary

Представлен набор протоколов, которые описывают измерение сократительной функции с помощью обнаружения длины саркомера наряду с переходным измерением кальция (Ca²⁺) в изолированных миоцитах крыс. Применение этого подхода для исследований на животных моделях сердечной недостаточности также включено.

Abstract

Сократительная дисфункция и транзиторы Ca²⁺ часто анализируются на клеточном уровне в рамках комплексной оценки сердечно-индуцированной травмы и / или ремоделирования. Один из подходов к оценке этих функциональных изменений использует ненагруженное укорочение и транзиторный анализ Ca²⁺ в первичных взрослых сердечных миоцитах. Для этого подхода взрослые миоциты выделяют путем переваривания коллагеназы, делают устойчивыми к Ca²⁺ , а затем прилипают к покрытым ламинином покровам с последующим электрическим темпом в средах, свободных от сыворотки. Общий протокол использует сердечные миоциты взрослых крыс, но может быть легко скорректирован для первичных миоцитов других видов. Функциональные изменения в миоцитах от поврежденных сердец можно сравнить с фиктивными миоцитами и / или с терапевтическим лечением in vitro . Методология включает в себя необходимые элементы, необходимые для кардиоцитарной стимуляции, а также клеточную камеру и компоненты платформы. Подробный протокол для этого подхода включает в себя этапы измерения ненагруженного укорочения путем обнаружения длины саркомера и сотовых переходных процессов Ca²⁺ , измеренных с помощью ратиометрического индикатора Fura-2 AM, а также для анализа необработанных данных.

Introduction

Анализ функции сердечного насоса часто требует ряда подходов для получения адекватного понимания, особенно для животных моделей сердечной недостаточности (HF). Эхокардиография или гемодинамические измерения дают представление о сердечной дисфункции in vivo ¹, в то время как подходы in vitro часто используются для определения того, возникает ли дисфункция из-за изменений в миофиламенте и / или транзиторе Ca²⁺ , ответственном за возбуждение связи, или потенциале действия со сократительной функцией (например, связь возбуждение-сокращение [E-C]). Подходы in vitro также дают возможность скрининга функционального ответа на нейрогормоны, векторно-индуцированные генетические изменения, а также потенциальные терапевтические агенты² до проведения дорогостоящих и/или трудоемких стратегий лечения in vivo .

Существует несколько подходов к исследованию сократительной функции in vitro, включая измерения силы в интактных трабекулах³ или пермеабилизированных миоцитах⁴, а также ненагруженное укорочение и транзиторы Ca²⁺ в интактных миоцитах в присутствии и отсутствии HF ^5,6. Каждый из этих подходов фокусируется на сократительной функции сердечных миоцитов, которая непосредственно отвечает за функцию сердечного насоса ^2,7. Тем не менее, анализ как сокращения, так и связи E-C вместе чаще всего выполняется путем измерения укорочения длины мышцы и переходных процессов Ca²⁺ в изолированных, устойчивых к Ca²⁺ взрослых миоцитах. Лаборатория использует подробный опубликованный протокол для выделения миоцитов из сердец крыс для этого шага⁸.

Как транзитор Ca²⁺, так и миофиламенты способствуют укорочению и повторному удлинению в интактных миоцитах и могут способствовать сократительной дисфункции ^2,7. Таким образом, этот подход рекомендуется, когда функциональный анализ in vitro требует интактного миоцита, содержащего велосипедный механизм Ca^{2 +} плюс миофиламенты. Например, интактные изолированные миоциты желательны для изучения сократительной функции после модификации миофиламента или циклической функции Ca²⁺ посредством переноса генов⁹. Кроме того, интактный миоцитарный подход предлагается для анализа функционального воздействия нейрогормонов при изучении влияния нисходящих вторичных сигнальных путей мессенджера и/или ответа на терапевтические агенты². Альтернативное измерение нагрузочно-зависимой силы в отдельных миоцитах чаще всего выполняется после мембранной пермеабилизации (или снятия кожи) при низких температурах (≤15 °C) для удаления переходного вклада Ca²⁺ и фокусировки на функции миофиламента¹⁰. Измерение зависящей от нагрузки силы плюс переходные процессы Ca²⁺ в интактных миоцитах встречается редко из-за сложной и технической проблемы подхода¹¹, особенно когда требуется более высокая пропускная способность, например, для измерения реакций на передачу сигналов нейрогормона или в качестве экрана для терапевтических агентов. Анализ сердечных трабекул преодолевает эти технические проблемы, но также может зависеть от немиоцитов, фиброза и / или ремоделирования внеклеточного матрикса². Каждый из описанных выше подходов требует препарата, содержащего взрослые миоциты, поскольку неонатальные миоциты и миоциты, полученные из индуцируемых плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), еще не экспрессируют полный комплемент взрослых белков миофиламента и обычно не имеют уровня организации миофиламента, присутствующего во взрослом палочковидном миоците². На сегодняшний день данные в иПСК указывают на то, что полный переход к взрослым изоформам превышает более 134 дней в культуре¹².

Учитывая акцент этой коллекции на HF, протоколы включают подходы и анализ для дифференциации сократительной функции в неисправных и недееспособных интактных миоцитах. Репрезентативные примеры приведены из крысиных миоцитов, изученных через 18-20 недель после надпочечниковой коарктации, описанной ранее ^5,13. Затем проводятся сравнения с миоцитами у крыс, обработанных фикцией.

Протокол и платформа визуализации, описанные здесь, используются для анализа и мониторинга изменений укорочения и транзиторов Ca²⁺ в палочковидных сердечных миоцитах во время развития HF. Для этого анализа 2 x 10⁴ Ca²⁺ -толерантные, палочковидные миоциты покрыты 22 мм² стеклянными крышками (CSs) с покрытием ламинин и культивируются в течение ночи, как описано ранее⁸. Компоненты, собранные для этой платформы визуализации, наряду с носителями и буферами, используемыми для оптимальной визуализации, представлены в Таблице материалов. Руководство по анализу данных с использованием программного обеспечения и репрезентативные результаты также представлены здесь. Общий протокол разбит на отдельные подразделы, причем первые три раздела посвящены изолированным миоцитам крыс и анализу данных, за которыми следуют клеточные эксперименты Ca^{2 +} и анализ данных в миоцитах.

Protocol

Исследования, проведенные на грызунах, проводились в соответствии с Политикой службы общественного здравоохранения в отношении гуманного ухода и использования лабораторных животных и были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Мичиганского универ?…

Representative Results

Исследования сократительной функции проводятся на миоцитах крыс, начиная со дня после выделения (день 2) до 4 дней после изоляции. Хотя миоциты могут быть зарегистрированы на следующий день после выделения (т. Е. День 2), часто требуется более длительное время культивирования после перено…

Discussion

Протокол хронической кардиостимуляции, описанный в шаге 1, продлевает полезное время для изучения изолированных миоцитов и оценки влияния более длительного лечения. В нашей лаборатории были получены последовательные результаты до 4 дней после изоляции при измерении сократительной фу…

Materials

MEDIA
Bovine serum albumin	Sigma (Roche)	3117057001	Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	Final concentration = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Final concentration = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin	Fisher	15140122	Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips	Corning	2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks	Pomona Electronics	B-36-2	Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp	Forma	1286	Multiple models are appropriate
Forceps – Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	1800-45
Low magnification inverted microscope	Leica	DM-IL	Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber	Custom		Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis	Ionoptix	Essential system components: — Photon counting system            –  Xenon power supply with dual excitation light source            –  Fluorescence interface	- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      – The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 – The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s)	Ionoptix	Myocam with CCD controller	Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).
Chamber stimulator	Ionoptix	Myopacer	Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber	Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F)		Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients	Ionoptix	PC with Ionwizard PC board and software	Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. – A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps – Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Insulated tube holder for media	Custom		Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope	Nikon	TE-2000S	Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table	TMC Vibration Control	30 x 36 inches	Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding
Microscope eyepieces & objective	Nikon	10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective	Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 and panel E
small weigh boat	Fisher	08-732-112
Temperature controller	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor	Sylvania	#72423 LED light	Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck – multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter	Fisher	Tygon tubing – E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask – 10-182-50B; Vacuum filter – 09-703-90	Panel A #11