Captação e Descelularização de Membros Posteriores de Rato Usando Biorreator Ex Vivo à Base de Perfusão para Alotransplante Composto Vascularizado
Summary
Descrevemos a técnica cirúrgica e o processo de descelularização de membros posteriores compostos de ratos. A descelularização é realizada usando dodecil sulfato de sódio de baixa concentração através de um sistema de perfusão de máquina ex vivo.
Abstract
Pacientes com lesões traumáticas graves e perda tecidual requerem reconstrução cirúrgica complexa. O alotransplante composto vascularizado (VCA) é uma via reconstrutiva em evolução para a transferência de múltiplos tecidos como uma subunidade composta. Apesar da natureza promissora da VCA, as necessidades imunossupressoras a longo prazo são uma limitação significativa devido ao aumento do risco de malignidades, toxicidade de órgãos-alvo e infecções oportunistas. A engenharia tecidual de andaimes compostos acelulares é uma alternativa potencial na redução da necessidade de imunossupressão. Neste documento, descreve-se a aquisição de um membro posterior de um rato e sua subsequente descelularização usando dodecil sulfato de sódio (SDS). A estratégia de aquisição apresentada baseia-se na artéria femoral comum. Um sistema de biorreator baseado em perfusão mecânica foi construído e utilizado para descelularização ex vivo do membro posterior. A descelularização perfusional bem-sucedida foi realizada, resultando em uma aparência branca translúcida do membro posterior. Observou-se uma rede vascular intacta, perfusável, em todo o membro posterior. As análises histológicas mostraram a remoção do conteúdo nuclear e a preservação da arquitetura tecidual em todos os compartimentos teciduais.
Introduction
A VCA é uma opção emergente para pacientes que necessitam de reconstrução cirúrgica complexa. Lesões traumáticas ou ressecções tumorais resultam em perda volumétrica de tecido que pode ser difícil de reconstruir. A VCA oferece o transplante de múltiplos tecidos, como pele, osso, músculo, nervos e vasos, como um enxerto composto de um doador para um receptor1. Apesar de sua natureza promissora, a VCA é limitada devido a regimes imunossupressores de longo prazo. O uso ao longo da vida dessas drogas resulta em aumento do risco de infecções oportunistas, neoplasias malignas e toxicidade de órgãos-alvo 1,2,3. Para ajudar a reduzir e/ou eliminar a necessidade de imunossupressão, os andaimes de engenharia de tecidos usando abordagens de descelularização para VCA mostram grande promessa.
A descelularização tecidual implica a retenção da estrutura da matriz extracelular enquanto remove o conteúdo celular e nuclear. Este andaime descelularizado pode ser repovoado com células específicas do paciente4. No entanto, preservar a rede de ECM de tecidos compostos é um desafio adicional. Isto é devido à presença de vários tipos de tecido com diferentes densidades de tecido, arquiteturas e locais anatômicos dentro de um andaime. O presente protocolo oferece uma técnica cirúrgica e um método de descelularização para um membro posterior de rato. Este é um modelo de prova de conceito para aplicar esta técnica de engenharia de tecidos a tecidos compósitos. Isso também pode levar a esforços subsequentes para regenerar tecidos compostos através da recelularização.
Protocol
Representative Results
Discussion
Membros posteriores de ratos são úteis como modelos experimentais na VCA5. A engenharia tecidual de andaimes acelulares representa o primeiro passo para abordar as deficiências dos regimes de imunossupressão a longo prazo associados à VCA. O uso de enxertos compostos representa um desafio adicional, dada a presença de múltiplos tecidos, cada um com propriedades funcionais, imunogênicas e estruturais únicas. O presente protocolo mostra um método bem-sucedido para a obtenção de membros p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A Figura 3A foi criada em BioRender.com.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade – #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
Referências
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