شراء وإزالة الخلايا من الأطراف الخلفية للفئران باستخدام مفاعل حيوي قائم على التروية خارج الجسم الحي لزراعة الخيول المركبة الوعائية
Summary
وصفنا التقنية الجراحية وعملية إزالة الخلايا للأطراف الخلفية للفئران المركبة. يتم إجراء عملية إزالة الخلايا باستخدام كبريتات دوديسيل الصوديوم منخفضة التركيز من خلال نظام تروية آلة خارج الجسم الحي .
Abstract
يحتاج المرضى الذين يعانون من إصابات رضحية شديدة وفقدان الأنسجة إلى إعادة بناء جراحية معقدة. زرع الأوعية الدموية المركب (VCA) هو وسيلة ترميمية متطورة لنقل أنسجة متعددة كوحدة فرعية مركبة. على الرغم من الطبيعة الواعدة ل VCA ، فإن متطلبات مثبطات المناعة طويلة الأجل تمثل قيدا كبيرا بسبب زيادة خطر الإصابة بالأورام الخبيثة وسمية الأعضاء النهائية والالتهابات الانتهازية. تعد هندسة الأنسجة للسقالات المركبة اللاخلوية بديلا محتملا في تقليل الحاجة إلى كبت المناعة. هنا ، يتم وصف شراء الطرف الخلفي للفئران وإزالة الخلايا اللاحقة باستخدام كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS). تعتمد استراتيجية الشراء المقدمة على الشريان الفخذي المشترك. تم بناء نظام مفاعل حيوي قائم على التروية الآلية واستخدامه لإزالة الخلايا خارج الجسم الحي من الطرف الخلفي. تم إجراء عملية إزالة الخلايا بالتروية بنجاح ، مما أدى إلى ظهور أبيض شفاف يشبه الطرف الخلفي. لوحظت شبكة وعائية سليمة وقابلة للتنفيذ في جميع أنحاء الطرف الخلفي. أظهرت التحليلات النسيجية إزالة المحتويات النووية والحفاظ على بنية الأنسجة عبر جميع حجرات الأنسجة.
Introduction
VCA هو خيار ناشئ للمرضى الذين يحتاجون إلى إعادة بناء جراحية معقدة. تؤدي الإصابات الرضحية أو استئصال الورم إلى فقدان الأنسجة الحجمية التي قد يكون من الصعب إعادة بنائها. تقدم VCA زرع أنسجة متعددة مثل الجلد والعظام والعضلات والأعصاب والأوعية كطعم مركب من متبرع إلى متلقي1. على الرغم من طبيعتها الواعدة ، فإن VCA محدودة بسبب الأنظمة المثبطة للمناعة طويلة الأجل. يؤدي استخدام هذه الأدوية مدى الحياة إلى زيادة خطر الإصابة بالعدوى الانتهازية والأورام الخبيثة وسمية الأعضاء النهائية1،2،3. للمساعدة في تقليل و / أو القضاء على الحاجة إلى كبت المناعة ، تظهر السقالات المهندسة للأنسجة باستخدام أساليب إزالة الخلايا ل VCA وعدا كبيرا.
يستلزم نزع الخلايا من الأنسجة الاحتفاظ بهيكل المصفوفة خارج الخلية مع إزالة المحتويات الخلوية والنووية. يمكن إعادة ملء هذه السقالة منزوعة الخلايا بخلايا خاصة بالمريض4. ومع ذلك ، فإن الحفاظ على شبكة ECM للأنسجة المركبة يمثل تحديا إضافيا. ويرجع ذلك إلى وجود أنواع متعددة من الأنسجة ذات كثافات الأنسجة المختلفة ، والبنى ، والمواقع التشريحية داخل السقالة. يقدم البروتوكول الحالي تقنية جراحية وطريقة إزالة الخلايا للطرف الخلفي للفئران. هذا نموذج إثبات المفهوم لتطبيق تقنية هندسة الأنسجة هذه على الأنسجة المركبة. يمكن أن يؤدي ذلك أيضا إلى بذل جهود لاحقة لتجديد الأنسجة المركبة من خلال إعادة الخلوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الأطراف الخلفية للفئران مفيدة كنماذج تجريبية في VCA5. تمثل هندسة الأنسجة للسقالات اللاخلوية الخطوة الأولى في معالجة أوجه القصور في أنظمة كبت المناعة طويلة الأجل المرتبطة ب VCA. يشكل استخدام الطعوم المركبة تحديا إضافيا نظرا لوجود أنسجة متعددة ، لكل منها خصائص وظيفية ومناعية وهي?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم إنشاء الشكل 3A في عام BioRender.com.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade – #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
Referências
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).
- Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871 (2020).
- Tao, M., et al. Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal. Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).
- Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts. Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Cohen, S., et al. Generation of vascular chimerism within donor organs. Scientific Reports. 11 (1), 13437 (2021).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Urciuolo, A., et al. Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration. Scientific Reports. 8 (1), 8398 (2018).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
