Indkøb og decellularisering af rottebagben ved hjælp af en ex vivo perfusionsbaseret bioreaktor til vaskulariseret sammensat allotransplantation
Summary
Vi beskriver den kirurgiske teknik og decellulariseringsproces for sammensatte rottebagben. Decellularisering udføres ved anvendelse af natriumdodecylsulfat med lav koncentration gennem et ex vivo-maskinperfusionssystem .
Abstract
Patienter med alvorlige traumatiske skader og vævstab kræver kompleks kirurgisk rekonstruktion. Vaskulariseret sammensat allotransplantation (VCA) er en udviklende rekonstruktiv vej til overførsel af flere væv som en sammensat underenhed. På trods af VCA’s lovende karakter er de langsigtede immunsuppressive krav en betydelig begrænsning på grund af den øgede risiko for maligniteter, slutorgantoksicitet og opportunistiske infektioner. Vævsteknik af acellulære kompositstilladser er et potentielt alternativ til at reducere behovet for immunsuppression. Heri beskrives indkøb af en rottebaglimb og dens efterfølgende decellularisering ved anvendelse af natriumdodecylsulfat (SDS). Den præsenterede indkøbsstrategi er baseret på den fælles lårbensarterie. Et maskinperfusionsbaseret bioreaktorsystem blev konstrueret og anvendt til ex vivo-decellularisering af bagbenet. Vellykket perfusion decellularisering blev udført, hvilket resulterede i et hvidt gennemskinneligt-lignende udseende af bagbenet. Et intakt, perfusabelt, vaskulært netværk i hele bagbenet blev observeret. Histologiske analyser viste fjernelse af nukleart indhold og bevarelse af vævsarkitektur på tværs af alle vævsrum.
Introduction
VCA er en ny mulighed for patienter, der kræver kompleks kirurgisk rekonstruktion. Traumatiske skader eller tumorresektioner resulterer i volumetrisk vævstab, der kan være vanskeligt at rekonstruere. VCA tilbyder transplantation af flere væv såsom hud, knogle, muskler, nerver og kar som et sammensat transplantat fra en donor til en modtager1. På trods af sin lovende karakter er VCA begrænset på grund af langsigtede immunsuppressive regimer. Livslang brug af sådanne lægemidler resulterer i øget risiko for opportunistiske infektioner, maligniteter og slutorgantoksicitet 1,2,3. For at hjælpe med at reducere og / eller eliminere behovet for immunsuppression viser vævskonstruerede stilladser ved hjælp af decellulariseringsmetoder til VCA meget lovende.
Vævsdecellularisering indebærer bevarelse af den ekstracellulære matrixstruktur, samtidig med at det cellulære og nukleare indhold fjernes. Dette decellulariserede stillads kan genbefolkes med patientspecifikke celler4. Det er imidlertid en ekstra udfordring at bevare ECM-netværket af sammensatte væv. Dette skyldes tilstedeværelsen af flere vævstyper med varierende vævstætheder, arkitekturer og anatomiske placeringer i et stillads. Den nuværende protokol tilbyder en kirurgisk teknik og en decellulariseringsmetode til en rotte bagben. Dette er en proof-of-concept-model til anvendelse af denne vævstekniske teknik på sammensatte væv. Dette kan også medføre efterfølgende bestræbelser på at regenerere sammensatte væv gennem recellularisering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rotte bagben er nyttige som eksperimentelle modeller i VCA5. Vævsteknik af acellulære stilladser repræsenterer det første skridt i at løse manglerne ved langsigtede immunsuppressionsregimer forbundet med VCA. Brugen af sammensatte transplantater udgør en ekstra udfordring i betragtning af tilstedeværelsen af flere væv, der hver har unikke funktionelle, immunogene og strukturelle egenskaber. Den nuværende protokol viser en vellykket metode til opnåelse af acellulære sammensatte rottebagb…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Figur 3A blev oprettet i BioRender.com.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade – #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
Referências
- Kueckelhaus, M., et al. Vascularized composite allotransplantation: Current standards and novel approaches to prevent acute rejection and chronic allograft deterioration. Transplant International. 29 (6), 655-662 (2016).
- Duisit, J., et al. Bioengineering a human face graft: The matrix of identity. Annals of Surgery. 266 (5), 754-764 (2017).
- Zhang, Q., et al. Decellularized skin/adipose tissue flap matrix for engineering vascularized composite soft tissue flaps. Acta Biomaterialia. 35, 166-184 (2016).
- Londono, R., Gorantla, V. S., Badylak, S. F. Emerging implications for extracellular matrix-based technologies in vascularized composite allotransplantation. Stem Cells International. 2016 (10), 1-16 (2016).
- Fleissig, Y. Y., Beare, J. E., LeBlanc, A. J., Kaufman, C. L. Evolution of the rat hind limb transplant as an experimental model of vascularized composite allotransplantation: Approaches and advantages. SAGE Open Medicine. 8, 205031212096871 (2020).
- Tao, M., et al. Sterilization and disinfection methods for decellularized matrix materials: Review, consideration and proposal. Bioactive Materials. 6 (9), 2927-2945 (2021).
- Chen, Y., Geerts, S., Jaramillo, M., Uygun, B. E. Preparation of decellularized liver scaffolds and recellularized liver grafts. Methods in Molecular Biology. 1577, 255-270 (2018).
- Ahmed, S., Chauhan, V. M., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. New generation of bioreactors that advance extracellular matrix modelling and tissue engineering. Biotechnology Letters. 41 (1), 1-25 (2019).
- Cohen, S., et al. Generation of vascular chimerism within donor organs. Scientific Reports. 11 (1), 13437 (2021).
- Lupon, E., et al. Engineering vascularized composite allografts using natural scaffolds: A systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. , (2021).
- Urciuolo, A., et al. Decellularised skeletal muscles allow functional muscle regeneration by promoting host cell migration. Scientific Reports. 8 (1), 8398 (2018).
- Jank, B. J., et al. Engineered composite tissue as a bioartificial limb graft. Biomaterials. 61, 246-256 (2015).
