Obtention et décellularisation de membres postérieurs de rat à l’aide d’un bioréacteur ex vivo basé sur la perfusion pour l’allotransplantation composite vascularisée
Summary
Nous décrivons la technique chirurgicale et le processus de décellularisation des membres postérieurs composites du rat. La décellularisation est réalisée à l’aide de dodécylsulfate de sodium à faible concentration à l’aide d’un système de perfusion machine ex vivo .
Abstract
Les patients présentant des lésions traumatiques graves et une perte de tissu nécessitent une reconstruction chirurgicale complexe. L’allotransplantation composite vascularisée (ACV) est une voie reconstructive évolutive pour le transfert de plusieurs tissus en tant que sous-unité composite. Malgré la nature prometteuse de l’ACV, les besoins immunosuppresseurs à long terme constituent une limitation importante en raison du risque accru de tumeurs malignes, de toxicité pour les organes terminaux et d’infections opportunistes. L’ingénierie tissulaire des échafaudages composites acellulaires est une alternative potentielle pour réduire le besoin d’immunosuppression. Ici, l’obtention d’un membre postérieur de rat et sa décellularisation ultérieure à l’aide de dodécylsulfate de sodium (SDS) sont décrites. La stratégie d’approvisionnement présentée est basée sur l’artère fémorale commune. Un système de bioréacteur à perfusion automatique a été construit et utilisé pour la décellularisation ex vivo du membre postérieur. Une décellularisation réussie de la perfusion a été réalisée, ce qui a donné un aspect blanc translucide du membre postérieur. Un réseau vasculaire intact et perfusable dans tout le membre postérieur a été observé. Les analyses histologiques ont montré l’élimination du contenu nucléaire et la préservation de l’architecture tissulaire dans tous les compartiments tissulaires.
Introduction
L’AVC est une option émergente pour les patients nécessitant une reconstruction chirurgicale complexe. Les lésions traumatiques ou les résections tumorales entraînent une perte de tissu volumétrique qui peut être difficile à reconstruire. VCA offre la transplantation de plusieurs tissus tels que la peau, les os, les muscles, les nerfs et les vaisseaux sous forme de greffe composite d’un donneur à un receveur1. Malgré sa nature prometteuse, l’ACV est limitée en raison des régimes immunosuppresseurs à long terme. L’utilisation à vie de ces médicaments augmente le risque d’infections opportunistes, de tumeurs malignes et de toxicité pour les organes terminaux 1,2,3. Pour aider à réduire et / ou éliminer le besoin d’immunosuppression, les échafaudages d’ingénierie tissulaire utilisant des approches de décellularisation pour VCA sont très prometteurs.
La décellularisation tissulaire consiste à conserver la structure de la matrice extracellulaire tout en éliminant le contenu cellulaire et nucléaire. Cet échafaudage décellularisé peut être repeuplé avec des cellules spécifiques au patient4. Cependant, la préservation du réseau ECM de tissus composites est un défi supplémentaire. Cela est dû à la présence de plusieurs types de tissus avec des densités, des architectures et des emplacements anatomiques variables dans un échafaudage. Le présent protocole propose une technique chirurgicale et une méthode de décellularisation pour un membre postérieur de rat. Il s’agit d’un modèle de preuve de concept pour appliquer cette technique d’ingénierie tissulaire aux tissus composites. Cela peut également inciter à des efforts ultérieurs pour régénérer les tissus composites par recellularisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les membres postérieurs du rat sont utiles comme modèles expérimentaux dans VCA5. L’ingénierie tissulaire des échafaudages acellulaires représente la première étape pour remédier aux lacunes des schémas d’immunosuppression à long terme associés à l’ACV. L’utilisation de greffons composites pose un défi supplémentaire compte tenu de la présence de plusieurs tissus, chacun ayant des propriétés fonctionnelles, immunogènes et structurelles uniques. Le présent protocole mont…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La figure 3A a été créée en BioRender.com.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade – #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
Referências
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