Obtención y descelularización de extremidades posteriores de ratas utilizando un biorreactor basado en perfusión ex vivo para alotrasplante compuesto vascularizado
Summary
Describimos la técnica quirúrgica y el proceso de descelularización para extremidades posteriores de ratas compuestas. La descelularización se lleva a cabo utilizando dodecil sulfato de sodio de baja concentración a través de un sistema de perfusión de máquina ex vivo .
Abstract
Los pacientes con lesiones traumáticas graves y pérdida de tejido requieren una reconstrucción quirúrgica compleja. El alotrasplante compuesto vascularizado (ACV) es una vía reconstructiva en evolución para transferir múltiples tejidos como una subunidad compuesta. A pesar de la naturaleza prometedora de VCA, los requisitos inmunosupresores a largo plazo son una limitación significativa debido al mayor riesgo de neoplasias malignas, toxicidad de órganos terminales e infecciones oportunistas. La ingeniería tisular de andamios compuestos acelulares es una alternativa potencial para reducir la necesidad de inmunosupresión. En este documento, se describe la obtención de una extremidad posterior de rata y su posterior descelularización utilizando dodecil sulfato de sodio (SDS). La estrategia de adquisición presentada se basa en la arteria femoral común. Se construyó un sistema de biorreactor basado en la máquina de perfusión y se utilizó para la descelularización ex vivo de la extremidad posterior. Se realizó con éxito la descelularización de perfusión, lo que resultó en una apariencia blanca translúcida de la extremidad posterior. Se observó una red vascular intacta y perfusible en toda la extremidad posterior. Los análisis histológicos mostraron la eliminación del contenido nuclear y la preservación de la arquitectura tisular en todos los compartimentos tisulares.
Introduction
VCA es una opción emergente para los pacientes que requieren reconstrucción quirúrgica compleja. Las lesiones traumáticas o las resecciones tumorales resultan en pérdida volumétrica de tejido que puede ser difícil de reconstruir. VCA ofrece el trasplante de múltiples tejidos como la piel, el hueso, el músculo, los nervios y los vasos como un injerto compuesto de un donante a un receptor1. A pesar de su naturaleza prometedora, VCA es limitado debido a los regímenes inmunosupresores a largo plazo. El uso a lo largo de la vida de tales medicamentos resulta en un mayor riesgo de infecciones oportunistas, neoplasias malignas y toxicidad en órganos terminales 1,2,3. Para ayudar a reducir y/o eliminar la necesidad de inmunosupresión, los andamios de ingeniería tisular que utilizan enfoques de descelularización para VCA son muy prometedores.
La descelularización tisular implica retener la estructura de la matriz extracelular mientras se elimina el contenido celular y nuclear. Este andamio descelularizado puede ser repoblado con células específicas del paciente4. Sin embargo, preservar la red ECM de tejidos compuestos es un desafío adicional. Esto se debe a la presencia de múltiples tipos de tejidos con diferentes densidades de tejido, arquitecturas y ubicaciones anatómicas dentro de un andamio. El presente protocolo ofrece una técnica quirúrgica y un método de descelularización para una extremidad posterior de rata. Este es un modelo de prueba de concepto para aplicar esta técnica de ingeniería de tejidos a tejidos compuestos. Esto también puede provocar esfuerzos posteriores para regenerar tejidos compuestos a través de la recelularización.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las extremidades posteriores de rata son útiles como modelos experimentales en VCA5. La ingeniería tisular de andamios acelulares representa el primer paso para abordar las deficiencias de los regímenes de inmunosupresión a largo plazo asociados con VCA. El uso de injertos compuestos plantea un desafío adicional dada la presencia de múltiples tejidos, cada uno con propiedades funcionales, inmunogénicas y estructurales únicas. El presente protocolo muestra un método exitoso para obtener ex…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La figura 3A se creó en BioRender.com.
Materials
| 0.9% Sodium Chloride Injection USP 50 mL | Baxter Corporation | JB1308M | |
| 1 mL Disposable Serological Pipets | VWR | 75816-102 | |
| 10 cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 3-way Stopcock | Obtained from Research Institution | ||
| 5cc Disposable Syringes | Obtained from Research Institution | ||
| 70% Isopropyl Alcohol | Obtained from Research Institution | ||
| Acrodisc Syringe Filter 0.2 µm | VWR | CA28143-310 | |
| Adson Forceps, Straight | Fine Science Tools | 11006-12 | |
| Angiocatheter 24 G 19 mm (¾”) | VWR | 38112 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100x) 100 mL | Multicell | 450-115-EL | |
| Bone Cutter | Fine Science Tools | 12029-12 | |
| Connectors for 1/16" to 1/8" Tubes | McMasterCarr | 5117K52 | |
| Female Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K328 | |
| Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Fine Forceps with Micro-Blunted Tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Heparin Sodium Injection 10,000 IU/10 mL | LEO Pharma Inc. | 006174-09 | |
| Male Luer to barbed adapter (PVDF) – 1/8" ID | McMasterCarr | 51525K322 | |
| Micro Needle Holder | WLorenz | 04-4125 | |
| Microscissors | WLorenz | SP-4506 | |
| Peracetic Acid | Sigma Aldrich | 269336-100ML | |
| Peristaltic Pump, 3-Channel | Cole Parmer | RK-78001-68 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x 500 mL | Wisent | 311-425-CL | |
| Povidone Surgical Scrub Solution | Obtained from Research Institution | ||
| Pump Tubing, 3-Stop, Tygon E-LFL | Cole Parmer | RK-96450-40 | |
| Pump Tubing, Platinum-Cured Silicone | Cole Parmer | RK-96410-16 | |
| Scalpel Blade – #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate Reagent Grade: Purity: >99%, 1 kg | Bioshop | SDS003.1 | |
| Surgical Suture #6-0 | Covidien | VS889 |
Referências
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