南瓜种间杂交的胚胎救援方案
Summary
本文描述了一种胚胎救援方案，用于再生源自 葫芦 和葫芦 葫芦的种间杂交的未成熟胚胎。该协议可以很容易地复制，并将成为南瓜育种计划的重要资源。
Abstract
葫芦作物（南瓜）的种间杂交对于扩大遗传变异和有用等位基因的渗入是理想的。由这些宽杂交产生的未成熟胚胎必须使用适当的胚胎修复技术再生。虽然这种技术在许多作物中已经很成熟，但缺乏对允许其常规应用的适当南瓜方法的详细描述。在这里，我们描述了一种胚胎救援方案，可用于C. pepo和C. moschata的种间杂交。为了确定胚胎救援的可行组合，进行了24个种间杂交。坐果从22个杂交中获得，表明成功率为92%。然而，获得的大多数果实都是单性生殖的，种子没有胚胎（空种子）。只有一个交叉组合包含可以使用基础植物生长培养基再生的未成熟胚胎。从种间F1果实中共抢救出10个胚胎，胚胎抢救成功率为80%。这里开发的胚胎救援方案将有助于南瓜育种项目中的种间杂交。
Introduction
葫芦（2n = 40）是葫芦科中一个高度多样化的属，包含27个不同的物种，其中5个被驯化1。其中，葫芦葫芦，C. pepo和C. maxima是全球最具经济重要性的。在美国，C. moschata和C. pepo是农业生产中最重要的两个物种。C. pepo 由四个亚种（卵形、卵形、花苔和古马拉）组成，包含弯颈、直颈、橡子、扇贝、椰子、蔬菜骨髓、西葫芦和南瓜2，3，4，5 的夏冬瓜品种组。C. moschata主要由冬瓜市场类型组成，包括胡桃，迪金森和奶酪组1。这两个物种在形态和表型上是多种多样的，C. pepo被认为是它的产量，早熟度，灌木生长习性以及多样化的果实性状，包括果实形状，果实大小，果肉颜色和外皮图案。另一方面，C. moschata因其对热量和湿度的适应以及抗病虫害而备受推崇6，7。C. moschata和C. pepo之间的种间杂交不仅是两个物种之间理想特征渗入的重要策略，而且还允许在育种计划中扩大遗传基础7，8。
C. moschata和C. pepo之间的早期杂交是为了确定它们的相容性和/或分类障碍9，10，11，而后来的研究主要集中在转移理想的性状12，13，14。两个物种之间的种间杂交旨在转移新性状，例如灌木或半灌木生长习性，提高C. pepo的产量以及抗病性，对非生物胁迫的适应性和增加C. moschata14，15，16的活力。例如，C. pepo（P5）和C. moschata（MO3）之间的特定杂交导致更高的果实产量13，而C. moschata种质（尼日利亚本地和Menina）已被广泛用作栽培C. pepo品种中对potyvirus抗性的主要来源17，18。
先前的研究表明，C. moschata和C. pepo之间的杂交是可能的，但很困难8，15。种间杂交可能导致没有坐果（流产），没有活种子的孤雌果实（空种子），未成熟胚胎无法发育的无籽果实（狭叶植物果实），或具有少量未成熟胚胎的果实可以通过胚胎救援拯救成成熟植物15，16。例如，通过杂交C. pepo（餐桌女王，母系）与C. moschata（大奶酪，父系）没有获得可行的种子，但是，互惠杂交从134次授粉中产生了57个可行的种子9。Hayase仅在上午04：00使用在10°C下储存过夜19的花粉进行杂交时，才从C. moschata和C. pepo杂交中获得活种子。Baggett将八个不同的C. moschata品种与C. pepo（熟食）杂交，并报告说，在103次总授粉中，获得了83种看起来正常的果实，但没有一个含有活种子8。在C. pepo（S179）和C. moschata（NK）的杂交中，Zhang等人获得了15个果实和2，994个种子，但其中只有12个种子是可行的，其余的只显示出基本的发育。这些研究表明，尽管C. moschata和C. pepo之间的种间杂交是非常有益的，但从杂交中获得具有可行种子的果实需要16。
胚胎抢救被认为是克服早期流产或发育不良引起的问题的适当方法，并且是最早和最成功的体外培养技术之一，用于再生未成熟胚胎16，20。胚胎挽救涉及对发育不足/未成熟的胚胎进行体外培养，然后转移到无菌营养培养基中，以促进幼苗和最终成熟植物的恢复21。虽然胚胎抢救通常用于南瓜育种，但缺乏对允许其常规应用的适当方法的详细描述。利用胚胎抢救技术克服葫芦种种间杂交障碍早在1954年就有报道22。然而，早期研究中胚胎抢救的成功率要么没有报道，要么非常低。Metwally等人报告说，从C. pepo和C. martinezii23杂交中分离出的100个种间杂交胚胎的成功率为10%（再生为成熟植物）。Sisko等人报道了从不同交叉组合获得的胚胎中胚胎再生的成功率不同：通过杂交C. maxima（Bos. Max）和C. pepo（淘金热）获得的杂交种的再生率为15.5%，C. pepo（西葫芦）和C. moschata（北海道）的再生率为20%，而C. pepo（淘金热）和C. moschata（Dolga）为37.5%24。 除基因型外，培养基和体外培养条件是该技术成功的重要因素25，26。在目前的研究中，测试了C. moschata和C. pepo之间的各种杂交组合，并开发了一种在南瓜中利用胚胎救援技术的简单方法。开发一种简单且易于复制的胚胎拯救技术将促进南瓜育种项目中的种间杂交和种质增强。
Protocol
Representative Results
Discussion
在C. moschata和C. pepo之间成功的种间杂交有两个主要瓶颈：交叉相容性屏障，这是由产生杂交胚胎的基因型反应性决定的，以及受精后屏障，它阻碍杂交胚胎发育为正常种子。正如之前报道的南瓜一样，当前研究中的交叉相容性测试显示，大多数水果是单性生殖的，大多数种子无法存活16。亲本基因型对莫沙塔桔梗与桔梗种间杂交的相容性有较大影响。?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了美国农业部国家食品和农业研究所NRS项目编号的支持。FLA-TRC-006176和佛罗里达大学食品和农业科学研究所。
Materials
| ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| autoclave | Steris | AMSCO LAB 250 | |
| balance | |||
| cefotaxime | Sigma Alfrich | C 7039 | |
| centrifuge tubes (1.5 ml) | Sigma Alfrich | T9661 | |
| detergent | |||
| ethanol, 95% | Decon Labs | 2805HC | |
| forceps | VWR | 82027-408 | |
| gellan gum | Caisson Laboratories | G024 | |
| growth chamber or illuminated shelf | |||
| laminar hood / biosafety cabinet | The Baker Company, Inc | Edgegard | |
| masking tape | Uline | S-11735 | |
| media bottle | |||
| Murashige & Skoog Medium | Research Products International | M10200 | |
| NPK fertilizer (20-20-20) | BWI Companies, Inc | PR200 | |
| Osmocote Plus fertilizer | BWI Companie,s Inc | OS90590 | |
| Parafilm M | Sigma Alfrich | P7793 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | USA Scientific, Inc | 8609-0160 | |
| plant pots | BWI Companies, Inc | NP4000BXL | |
| plastic food containers, reused | Oscar Mayer | 4470003330 | |
| plastic hang tags | Amazon | B07QTZRY6T | |
| potting mix | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| seedling starter trays | BWI Companies Inc | GPPF128S4 | |
| syringe filter (0.22 um ) | ExtraGene | B25CA022-S | |
| trellis support | The Home Depot | 2A060006 | |
| water bath |
Referências
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