Embryo Rescue Protocol för interspecifik hybridisering i squash
Summary
Artikeln beskriver ett embryoräddningsprotokoll för regenerering av omogna embryon härrörande från den interspecifika hybridiseringen av Cucurbita pepo och Cucurbita moschata. Protokollet kan enkelt replikeras och kommer att vara en viktig resurs för squashavelsprogram.
Abstract
Interspecifik hybridisering i Cucurbita-grödor (squash) är önskvärt för att bredda genetisk variation och för introgression av användbara alleler. Omogna embryon som genereras från dessa breda korsningar skall regenereras med hjälp av lämpliga metoder för embryoräddning. Även om denna teknik är väl etablerad för många grödor, saknas en detaljerad beskrivning av lämplig metod för squash som skulle möjliggöra dess rutinmässiga tillämpning. Här beskriver vi ett embryoräddningsprotokoll som är användbart för interspecifik hybridisering av C. pepo och C . moschata. För att identifiera livskraftiga kombinationer för embryoräddning utfördes 24 interspecifika kors. Fruktuppsättningen erhölls från tjugotvå kors, vilket indikerar en framgångsgrad på 92%. De flesta av de erhållna frukterna var emellertid parthenokarpiska, med frön som saknade embryon (tomma frön). Endast en korskombination innehöll omogna embryon som kunde regenereras med hjälp av basala växttillväxtmedier. Totalt 10 embryon räddades från den interspecifika F1-frukten , och framgångsgraden för embryoräddning var 80%. Embryoräddningsprotokollet som utvecklats här kommer att vara användbart för interspecifik hybridisering i squashuppfödningsprogram.
Introduction
Cucurbita (2n = 40) är ett mycket varierat släkte i familjen Cucurbitaceae som innehåller 27 olika arter, varav fem är domesticerade1. Bland dessa är Cucurbita moschata, C. pepo och C. maxima de ekonomiskt viktigaste i världen. I USA är C. moschata och C. pepo de två viktigaste arterna i jordbruksproduktionen. C. pepo består av fyra underarter (ovifera, pepo, fraternal och gumala) som innehåller både sommar- och vintersquashsortgrupper av crookneck, straightneck, ekollon, kammussla, cocozelle, grönsaksmärg, zucchini och pumpa 2,3,4,5. C. moschata består främst av vintersquashmarknadstyper inklusive butternut, Dickinson och ostgrupp1. De två arterna är morfologiskt och fenotypiskt olika, med C. pepo betraktad för sitt utbyte, earliness, busktillväxtvanor och olika fruktegenskaper inklusive fruktform, fruktstorlek, köttfärg och skalmönster. Å andra sidan är C. moschata uppskattad för sin anpassning till värme och fuktighet, liksom sjukdoms- och skadedjursresistens 6,7. Interspecifik hybridisering mellan C. moschata och C. pepo är inte bara en viktig strategi för introgression av önskvärda egenskaper mellan de två arterna, utan möjliggör också breddning av den genetiska basen i avelsprogram 7,8.
Tidiga korsningar mellan C. moschata och C. pepo gjordes för att bestämma deras kompatibilitet och / eller taxonomiska hinder 9,10,11, medan senare studier mestadels fokuserade på att överföra önskvärda egenskaper12,13,14. Interspecifik hybridisering mellan de två arterna har riktat överföringen av nya egenskaper som en busk- eller halvbusketillväxtvana och förbättrat utbyte från C. pepo tillsammans med sjukdomsresistens, anpassningsförmåga till abiotisk stress och ökad kraft från C. moschata14,15,16. Till exempel har specifika korsningar mellan C. pepo (P5) och C. moschata (MO3) resulterat i högre fruktavkastning 13, medan C. moschata -anslutningar (nigerianska lokala och Menina) har använts i stor utsträckning som den primära källan till resistens mot potyvirus i odlade C. pepo -sorter17,18.
Tidigare studier visade att hybridisering mellan C. moschata och C. pepo är möjlig men svår 8,15. De interspecifika korsen kan resultera i ingen fruktuppsättning (abort), parthenokarpiska frukter utan livskraftiga frön (tomma frön), fröfria frukter där de omogna embryona inte utvecklas (stenospermocarpy) eller frukter med få omogna embryon som kan räddas till mogna växter genom embryoräddning15,16. Till exempel erhölls inga livskraftiga frön genom att korsa C. pepo (bordsdrottning, moder) med C. moschata (stor ost, fader), men det ömsesidiga korset gav 57 livskraftiga frön från 134 pollineringar9. Hayase erhöll livskraftiga frön från C. moschata och C. pepo korsar endast när korsningar gjordes klockan 04:00 med pollen lagrad vid 10 ° C över natten19. Baggett korsade åtta olika C. moschata -sorter med C. pepo (delicata) och rapporterade att av 103 totala pollineringar erhölls 83 frukter som verkade normala, men ingen av dem innehöll livskraftiga frön8. I en korsning mellan C. pepo (S179) och C. moschata (NK) erhöll Zhang et al. 15 frukter med 2 994 frön, men endast 12 av dessa frön var livskraftiga medan de återstående endast visade rudimentär utveckling. Dessa studier tyder på att även om interspecifik korsning mellan C. moschata och C. pepo är mycket fördelaktig, är det krävande att få frukt med livskraftiga frön från korsen16.
Embryoräddning har föreslagits som en lämplig metod för att övervinna problem som uppstår till följd av tidiga aborter eller dåligt utvecklade embryon och är en av de tidigaste och mest framgångsrika in vitro-odlingsteknikerna för regenerering av omogna embryon16,20. Embryoräddning involverar in vitro-odling av underutvecklade/omogna embryon följt av överföring till ett sterilt näringsmedium för att underlätta återhämtning av plantor och i slutändan mogna växter21. Även om embryoräddning vanligtvis används vid squashuppfödning, saknas en detaljerad beskrivning av lämplig metod som skulle möjliggöra dess rutinmässiga tillämpning. Att använda embryoräddningsteknik för att övervinna interspecifika hybridiseringsbarriärer hos Cucurbita-arter rapporterades redan 195422. Framgången med embryoräddning i de tidiga studierna var dock antingen orapporterad eller mycket låg. rapporterade en framgångsgrad på 10% (regenerering till mogna växter) bland 100 interspecifika hybridembryon som räddades från en korsning mellan C. pepo och C. martinezii23. rapporterade en varierande framgångsgrad för embryoregenerering bland embryon erhållna från olika korskombinationer: regenereringshastigheten för hybrider erhållna genom att korsa C. maxima (Bos. Max) och C. pepo (Gold Rush) var 15,5%, för C. pepo (Zucchini) och C. moschata (Hokaido) var 20%, medan det för C. pepo (Gold Rush) och C. moschata (Dolga) var 37,5%24. Förutom genotyp är media- och in vitro-odlingsförhållanden viktiga faktorer för framgången med tekniken25,26. I den aktuella studien testades olika korskombinationer mellan C. moschata och C. pepo, och en enkel metod för att använda embryoräddningstekniken i squash utvecklades. Utvecklingen av en enkel och lätt reproducerbar embryoräddningsteknik kommer att underlätta interspecifik hybridisering och bakterieplasmaförbättring i squashavelsprogram.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns två huvudsakliga flaskhalsar för framgångsrik interspecifik hybridisering mellan C. moschata och C. pepo: korskompatibilitetsbarriär, som bestäms av genotyprespons för att producera hybridembryon, och efterbefruktningsbarriärer, som hindrar utvecklingen av hybridembryon till normala frön. Som tidigare rapporterats för squash avslöjade korskompatibilitetstestet i den aktuella studien att det mesta av frukten utvecklades parthenokarptiskt, med de flesta frön oföränderliga<sup class=…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av USDA National Institute of Food and Agriculture, NRS Project No. FLA-TRC-006176 och University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences.
Materials
| ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| autoclave | Steris | AMSCO LAB 250 | |
| balance | |||
| cefotaxime | Sigma Alfrich | C 7039 | |
| centrifuge tubes (1.5 ml) | Sigma Alfrich | T9661 | |
| detergent | |||
| ethanol, 95% | Decon Labs | 2805HC | |
| forceps | VWR | 82027-408 | |
| gellan gum | Caisson Laboratories | G024 | |
| growth chamber or illuminated shelf | |||
| laminar hood / biosafety cabinet | The Baker Company, Inc | Edgegard | |
| masking tape | Uline | S-11735 | |
| media bottle | |||
| Murashige & Skoog Medium | Research Products International | M10200 | |
| NPK fertilizer (20-20-20) | BWI Companies, Inc | PR200 | |
| Osmocote Plus fertilizer | BWI Companie,s Inc | OS90590 | |
| Parafilm M | Sigma Alfrich | P7793 | |
| Petri dish (60 x 15 mm) | USA Scientific, Inc | 8609-0160 | |
| plant pots | BWI Companies, Inc | NP4000BXL | |
| plastic food containers, reused | Oscar Mayer | 4470003330 | |
| plastic hang tags | Amazon | B07QTZRY6T | |
| potting mix | Jolly Gardener | Pro-Line C/B | |
| seedling starter trays | BWI Companies Inc | GPPF128S4 | |
| syringe filter (0.22 um ) | ExtraGene | B25CA022-S | |
| trellis support | The Home Depot | 2A060006 | |
| water bath |
Referências
- Paris, H. S., Grumet, R., Katzir, N., Garcia-Mas, J. Genetic Resources of Pumpkins and Squash, Cucurbita spp. Genetics and Genomics of Cucurbitaceae. Plant Genetics and Genomics: Crops and Models. 20, (2016).
- Gong, L., Stift, G., Kofler, R., Pachner, M., Lelley, T. Microsatellites for the genus Cucurbita and an SSR-based genetic linkage map of Cucurbita pepo L. Theoretical and Applied Genetics. 117 (1), 37-48 (2008).
- Paris, H. S., et al. Assessment of genetic relationships in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae) using DNA markers. Theoretical and Applied Genetics. 106 (6), 971-978 (2003).
- Robinson, R. W., Decker-Walters, D. S. . Cucurbits. , (1997).
- Teppner, H. Cucurbita pepo (Cucurbitaceae)-history, seed coat types, thin coated seeds and their genetics. Phyton (Horn). 40 (1), 1-42 (2000).
- Hazra, P., Mandal, A. K., Dutta, A. K., Ram, H. H. Breeding pumpkin (Cucurbita moschata Duch. Ex Poir.) for fruit yield and other characters. International Journal of Plant Breeding. 1 (1), 51-64 (2007).
- Paris, H. S. History of the cultivar-groups of Cucurbita pepo. Horticultural Reviews-Westport Then New York. 25, 71 (2001).
- Baggett, J. R. Attempts to cross Cucurbita moschata (Duch.) Poir. ‘Butternut and C. pepo L. ‘Delicata’. The Cucurbit Genetics Cooperative. 2, 32-34 (1979).
- Erwin, A. T., Haber, E. S. Species and Varietal Crosses in Cucurbits. Agricultural Experiment Station, Iowa State College of Agriculture and Mechanical Arts. , (1929).
- Whitaker, T. W., Bohn, G. W. The taxonomy, genetics, production and uses of the cultivated species of Cucurbita. Economic Botany. 4 (1), 52-81 (1950).
- Bemis, W. P., Nelson, J. M. Interspecific hybridization within the genus Cucurbita I, fruit set, seed and embryo development. Journal of the Arizona Academy of Science. 2 (3), 104-107 (1963).
- Washek, R. L., Munger, H. M. Hybridization of Cucurbita pepo with disease resistant Cucurbita species. The Cucurbit Genetics Cooperative. 6, 92 (1983).
- Davoodi, S., Olfati, J. A., Hamidoghli, Y., Sabouri, A. Standard heterosis in Cucurbita moschata and Cucurbita pepo interspecific hybrids. International Journal of Vegetable Science. 22 (4), 383-388 (2016).
- De Oliveira, A. C. B., Maluf, W. R., Pinto, J. E. B., Azevedo, S. M. Resistance to papaya ringspot virus in summer squash Cucurbita pepo L. introgressed from an interspecific C. pepo× C. moschata cross. Euphytica. 132 (2), 211-215 (2003).
- Rakha, M. T., Metwally, E. I., Moustafa, S. A., Etman, A. A., Dewir, Y. H. Production of Cucurbita interspecific hybrids through cross pollination and embryo rescue technique. World Applied Sciences Journal. 20 (10), 1366-1370 (2012).
- Zhang, Q. I., Yu, E., Medina, A. Development of advanced interspecific-bridge lines among Cucurbita pepo, C. maxima, and C. moschata. HortScience. 47 (4), 452-458 (2012).
- Brown, R. N., Bolanos-Herrera, A., Myers, J. R., Miller Jahn, M. Inheritance of resistance to four cucurbit viruses in Cucurbita moschata. Euphytica. 129 (3), 253-258 (2003).
- Pachner, M., Paris, H. S., Winkler, J., Lelley, T. Phenotypic and marker-assisted pyramiding of genes for resistance to zucchini yellow mosaic virus in oilseed pumpkin (Cucurbita pepo). Plant Breeding. 134 (1), 121-128 (2015).
- Hayase, H. Cucurbita-crosses. XV. Flower pollination at 4 am in the production of C. pepo x C. moschata F1 hybrids. Japanese Journal of Breeding. 13 (2), 76-82 (1963).
- Reed, S. Embryo rescue. Plant development and biotechnology. , 235-239 (2004).
- Sharma, D. R., Kaur, R., Kumar, K. Embryo rescue in plants-a review. Euphytica. 89 (3), 325-337 (1996).
- Wall, J. R. Interspecific hybrids of Cucurbita obtained by embryo culture. Proceedings of the American Society of Horticultural Science. 63, 427-430 (1954).
- Metwally, E. I., Haroun, S. A., El-Fadly, G. A. Interspecific cross between Cucurbita pepo L. and Cucurbita martinezii through in vitro embryo culture. Euphytica. 90 (1), 1-7 (1996).
- Sisko, M., Ivancic, A., Bohanec, B. Genome size analysis in the genus Cucurbita and its use for determination of interspecific hybrids obtained using the embryo-rescue technique. Plant Science. 165 (3), 663-669 (2003).
- Giancaspro, A., et al. Optimization of an in vitro embryo rescue protocol for breeding seedless table grapes (Vitis vinifera L.) in Italy. Horticulturae. 8 (2), 121 (2022).
- Warchol, M., et al. The effect of genotype, media composition, pH and sugar concentrations on oat (Avena sativa L.) doubled haploid production through oat x maize crosses. Acta Physiologiae Plantarum. 40 (5), 1-10 (2018).
- Nepi, M., Pacini, E. Pollination, pollen viability and pistil receptivity in Cucurbita pepo. Annals of Botany. 72 (6), 527-536 (1993).
- Harvey, W. J., Grant, D. G., Lammerink, J. P. Physical and sensory changes during development and storage of buttercup squash. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science. 25 (4), 341-351 (1997).
- Moon, P., Meru, G. Embryo rescue of aged Cucurbita pepo seeds using squash rescue medium. Journal of Horticultural Science and Research. 2 (1), 62-69 (2018).
- Nuñez-Palenius, H. G., Ramírez-Malagón, R., Ochoa-Alejo, N. Muskmelon embryo rescue techniques using in vitro embryo culture. Plant Embryo Culture. , 107-115 (2011).
- Vining, K. J., Loy, J. B., McCreight, J. M. Seed development and seed fill in hull-less seeded cultigens of pumpkin (Cucurbita pepo L). Cucurbitaceae 98: Evaluation and Enhancement of Cucurbit Germplasm. , 64-69 (1998).
- Vining, K. J. . Seed development in hull-less-seeded pumpkin (Cucurbita pepo L.). , (1999).
