Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטות לביטוי טרנסגני בלבבות חולדות ועכברים על ידי הזרקה ישירה של הנגיף בהנחיית אקוקרדיוגרפיה. שיטות להערכת הרגישות של לבבות להפרעות קצב חדריות על ידי גירוי חשמלי מתוכנת של לבבות מבודדים, Langendorff-perfused מוסברים גם כאן.
Abstract
מחלות לב הן הגורם המוביל לתחלואה ולתמותה ברחבי העולם. בשל קלות הטיפול והשפע של זנים מהונדסים, מכרסמים הפכו למודלים חיוניים למחקר לב וכלי דם. עם זאת, הפרעות קצב לב קטלניות ספונטניות שלעתים קרובות גורמות לתמותה בחולי מחלות לב הן נדירות במודלים של מכרסמים של מחלות לב. הסיבה העיקרית לכך היא ההבדלים בין המינים בתכונות החשמליות של הלב בין בני אדם למכרסמים ומהווה אתגר לחקר הפרעות קצב לב באמצעות מכרסמים. פרוטוקול זה מתאר גישה המאפשרת ביטוי טרנסגני יעיל בשריר הלב של עכברים וחולדות באמצעות זריקות תוך-שריריות מונחות אקוקרדיוגרפיה של נגיף רקומביננטי (אדנו-וירוס ונגיף הקשור לאדנו). עבודה זו גם מתווה שיטה המאפשרת הערכה אמינה של רגישות הלב להפרעות קצב באמצעות עכברים ולבבות עכברים וחולדות מבודדים, לנגנדורף, עם גירויים חשמליים אדרנרגיים ומתוכנתים. טכניקות אלה הן קריטיות לחקר הפרעות בקצב הלב הקשורות לשיפוץ לב שלילי לאחר פציעות, כגון אוטם שריר הלב.
Introduction
מחלות לב וכלי דם הן סיבת המוות המובילה בעולם, וגבו את חייהם של 18 מיליון אנשים בשנת 2017 לבדה1. מכרסמים, במיוחד עכברים וחולדות, הפכו למודל הנפוץ ביותר במחקר קרדיווסקולרי בשל קלות הטיפול והזמינות של ביטויי יתר מהונדסים שונים או קווי נוקאאוט. מודלים של מכרסמים היו בסיסיים להבנת מנגנוני המחלה ולזיהוי מטרות טיפוליות חדשות פוטנציאליות באוטם שריר הלב2, יתר לחץ דם3, אי ספיקת לב4 וטרשת עורקים5. עם זאת, השימוש במכרסמים במחקרים על הפרעות קצב לב מוגבל על ידי גודל הלב הקטן שלהם וקצב הלב המהיר יותר בהשוואה למודלים אנושיים או בעלי חיים גדולים. לכן, הפרעות קצב קטלניות ספונטניות בעכברים או בחולדות לאחר אוטם שריר הלב הן נדירות2. החוקרים נאלצים להתמקד בשינויים משניים עקיפים שעשויים לשקף מצע פרו-אריתמי, כגון פיברוזיס או ביטוי גנים, מבלי להראות שינויים משמעותיים בעומס הפרעות קצב או נטיות פרו-קצביות. כדי להתגבר על מגבלה זו, שיטה המאפשרת הערכה אמינה של הרגישות של לבבות עכברים וחולדות לטכיאריתמיות חדריות לאחר שינוי גנטי 6,7 או אוטם שריר הלב2 מתוארת בפרוטוקול הנוכחי. שיטה זו משלבת גירוי קולטן אדרנרגי עם גירוי חשמלי מתוכנת כדי לגרום לטכיאריתמיות חדריות בלבבות עכברים וחולדותמבודדים, מסוג Langendorff-perfused.
גישות סטנדרטיות להעברת גנים נגיפיים ברקמת שריר הלב של מכרסמים כרוכות לעתים קרובות בחשיפת הלב על ידי בית החזה 9,10,11, שהוא הליך פולשני וקשור להתאוששות מאוחרת של בעלי החיים לאחר ההליך. מאמר זה מתאר שיטה של הזרקה ישירה של וירוס בהזרקה ישירה של הנגיף תחת הדרכת הדמיה אולטרסאונד לביטוי יתר של טרנסגנים. הליך פחות פולשני זה מאפשר התאוששות מהירה יותר של בעלי החיים לאחר הזרקה נגיפית ופחות פגיעה ברקמות, בהשוואה לבית החזה, מפחית כאב ודלקת לאחר הניתוח בבעל החיים, ובכך מאפשר הערכה טובה יותר של ההשפעות של גנים מהונדסים על תפקוד הלב.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות והנהלים המתוארים אושרו על ידי הוועדה לביקורת אתית של מחקר בבעלי חיים באוניברסיטת אוטווה והוועדה לבדיקת בטיחות ביולוגית במכון הלב של אוניברסיטת אוטווה. פרוטוקולי הבטיחות שפותחו כוללים כי כל ההליכים העוסקים באדנווירוס רקומביננטי או בווירוס הקשור לאדנו (AAV) בוצעו בארון בטיחות ביולוגית ברמה II. כל הפריטים שהיו במגע עם הנגיף פורקו לחלוטין לאחר הניסוי. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי Ctnnb1 flox/flox ו-αMHC-MerCreMer (בני 8-12 שבועות, משני המינים) ובחולדות ספראג-דאולי (200-250 גרם, זכר). החיות התקבלו ממקורות מסחריים (ראו טבלת חומרים). כל ההליכים העוסקים בבעלי חיים בוצעו על ידי אנשי צוות שהוכשרו ואושרו על ידי ועדות רגולטוריות מוסדיות. ציוד מגן אישי מתאים שימש במהלך כל ההליכים.
1. ביטוי טרנסגנים ויראליים ברקמות חדריות מכרסמים
הערה: אחסן אדנו-וירוס רקומביננטי או AAV המבטא את גן היעד ואת וירוס הבקרה המתאים, כגון Ad-GFP (טיטר של 1 x 10 10 PFU/mL) או AAV9-GFP (טיטר של 1 x 1013 GC/mL) (ראה טבלת חומרים), במקפיא של −80 מעלות צלזיוס.
- ביום הזרקת הנגיף, הפשירו את הנגיף על הקרח. שאפו את הנגיף המבטא את גן המטרה ואת נגיף הבקרה לשני מזרקים נפרדים (נפח = 50 μL) עם 30 G 1/2 מחטים ושמרו על קרח עד לשימוש.
הערה: יש להסיר בזהירות את כל הבועות במזרק ובמחט. - מתן בופרנורפין לחולדות או עכברים (0.05 מ"ג/ק"ג לחולדות, 0.1 מ"ג/ק"ג לעכברים, תת-עוריים), שעה אחת לאחר מכן לגרום להרדמה באמצעות 3% איזופלורן, ולשמור על איזופלורן ב-2% (ב-100% חמצן בקצב זרימה של 0.5-1.0 ליטר/דקה) לצורך ההליך הבא.
- צובטים בעדינות את גוף החיה (למשל, הזנב) עם זוג מלקחיים, ואם החיה אינה מגיבה לצביטה בתנועות גוף כלשהן, מאושר הרדמה נכונה.
- יש לשמור על טמפרטורת הגוף ב-37°C באמצעות כרית חימום חשמלית. לגלח את השיער באזור החזה באמצעות גוזז שיער.
הערה: יש להקפיד על שימוש בכרית חימום חשמלית עקב פיזור חום לא אחיד פוטנציאלי. - יש למרוח משחה אופטלמית על שתי העיניים כדי למנוע את התייבשות הקרנית.
- השאירו את בעל החיים במצב שכיבה והשתמשו במערכת הדמיה פרה-קלינית (ראו טבלת חומרים) להדמיית אולטרסאונד של לב החיה בכיוון הציר הקצר.
הערה: השלבים הבאים מבוצעים בארון בטיחות ביולוגית ברמה II המספק סביבה סטרילית. נהלי בטיחות סטנדרטיים, כולל אלה עם טיפול בטוח במחט, מיושמים. - לעקר את אזור החזה התחתון השמאלי של החיה עם סיבובים מתחלפים של קרצוף מבוסס יוד או על בסיס כלורהקסידין ואלכוהול שלוש פעמים בתנועה מעגלית.
- בהנחיית הדמיית אולטרסאונד, יש להחדיר את המחט 30 G 1/2 של המזרק המכיל את הנגיף כפי שהוכן בשלב 1.1. לתוך החזה של החיה דרך צד החזה התחתון השמאלי של הגוף.
- מתקרבים לקצה המחט לתוך הקיר החופשי הקדמי של החדר השמאלי ומזריקים באיטיות 10-15 μL של הנגיף. ודא הזרקה מוצלחת בתמונות אולטרסאונד על ידי הבהירות המשופרת ליד קצה המחט.
הערה: כמות הנגיף המוזרק בכל אתר אינה עולה על 15 μL כדי למנוע נזק פיזי לרקמות שריר הלב. - למשוך את המחט מהלב ולהחדיר אותו לאזורים אחרים של החדר השמאלי עבור זריקה שנייה ושלישית של אותה כמות של הנגיף.
הערה: המספר הכולל של אתרי ההזרקה נקבע על ידי תכנון הניסוי. אם נדרש ביטוי טרנסגני מוקדי, יש צורך בזריקה אחת בלבד; אם נדרש ביטוי טרנסגני מפוזר יותר, יש צורך בדרך כלל באתרי הזרקה מרובים (שלושה עד חמישה). - לאחר השלמת הזריקות, להחזיר את החיה לכלוב שלה.
- עקוב בזהירות אחר החיה עד שהיא חזרה להכרה מספקת כדי לשמור על משענת החזה ולהחזיר אותה לחדר המגורים שלה.
- יש לתת בופרנורפין הידרוכלוריד (0.1 מ"ג/ק"ג, פעמיים ביום לעכברים, 0.05 מ"ג/ק"ג, פעמיים ביום לחולדות, תת-עוריות) לבעל החיים במשך היומיים הבאים. החזירו בעלי חיים לוויבריום ועקבו מדי יום אחר כל סימן חריג של כאב או מצוקה, ואם נמצאו, טפלו בבעלי חיים בהתאם לפרוטוקולים של הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים.
2. הערכה של רגישות להפרעות קצב לב
הערה: ב 4-6 ימים לאחר הזרקת אדנווירוס ו 1-2 שבועות לאחר הזרקת AAV, להעריך את הרגישות של לבבות בעלי חיים להפרעות קצב לב בעקבות שלבים 2.1.-2.2.
- בצע זלוף לנגנדורף של לב החולדה או העכבר.
- הכן תמיסת טירודה על ידי הוספת הדברים הבאים ל 1 ליטר מים: NaCl, 7.9 גרם (סופי = 135 mM); KCl, 0.37 גרם (5.0 מ"מ); CaCl2, 0.27 גרם (1.8 mM); MgCl 2, 0.24 גרם (1.2 מ"מ); HEPES, 2.38 גרם (10 מ"מ); וגלוקוז, 1.8 גרם (10 מ"מ). התאם את ה-pH ל-7.40 באמצעות NaOH (ראו טבלת חומרים).
- סנן את התמיסה באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר ובועה עם 100% O 2 ברציפות בשלבים 2.1.6.-2.2.8.
- לתת הפרין לחולדה או לעכבר (500 U/kg, הזרקה תוך-צפקית) וכעבור 10 דקות להרדים את החיה עם 3% איזופלורן. הקפידו על הרדמה מספקת עם צביטה עדינה על הגוף.
- השתמש באזמל כדי לבצע חתך אנכי של 1-1.5 ס"מ בקו אמצע עצם הבריח לכריתת בית החזה השמאלית ולחשוף את הלב.
- לאסוף את הלב על ידי חיתוך עם זוג מספריים ברמת קשת אבי העורקים ומיד לשים את הלב לתוך תמיסת טירוד קר כקרח.
הערה: יש להיזהר שלא לגרום נזק ללב במהלך איסוף הלב. - ניתן למצות את אבי העורקים של הלב באמצעות מחט קהה (18 גרם לחולדות; 23 גרם לעכברים) המחוברת למערכת פרפוזיה שונה של לנגנדורף (ראו טבלת חומרים) במצב קצב זרימה קבוע. התאם את קצב הזרימה כדי לשמור על לחץ הזלוף על 70-80 מ"מ כספית.
הערה: יש להסיר את כל הבועות במחט הזלוף לפני ביצוע קנולציה של אבי העורקים. שימוש במיקרוסקופ חיתוך מקל על הצינור. - מניחים את הלב המשומר בצלחת פלסטיקמצופה סיליקון 9, 10 ס"מ עם החדר השמאלי פונה כלפי מעלה ומחלחלים ללב 9,12 עם תמיסת טירודה O2-bubbled ב 37 מעלות צלזיוס.
- ודא את cannulation אבי העורקים הנכון בתחילת perfusion על ידי התבוננות שטיפת הדם מהלב במהלך שתיים עד שלוש פעימות הלב הראשונות ואת שינוי צבע הלב מאדום חיוור.
- הניחו את האלקטרודות של מערכת א.ק.ג. של בעלי חיים קטנים (ראו טבלת חומרים) סביב הלב על ידי החדרתן לציפוי הסיליקון אלסטומר בצלחת (איור 1). הקלט אק"ג באמצעות תוכנה תואמת.
- בצע גירוי קולטן אדרנרגי וגירוי חשמלי מתוכנת כדי לגרום לטכיאריתמיות חדריות.
- לאחר קנולציה מוצלחת של אבי העורקים, ממשיכים לחדור ללב עם תמיסת טירוד למשך 20 דקות כדי לייצב את הכנת הלב.
- הוסף איזופרוטרנול 1 μM (ראה טבלת חומרים) לתמיסת הטירודה המשמשת לזילוף לב בשלבים 2.2.3.-2.2.8.
- לאחר 10 דקות של זליגת איזופרוטארנול, עוררו את הלב בנקודת השיא באמצעות שתי אלקטרודות פלטינה המחוברות לממריץ חשמלי (ראו טבלת חומרים).
- התחילו עם הליך הגירוי (איור 2), הכולל 10 גירויים עוקבים (מרווחים של S1, 5 V, 100 אלפיות השנייה) שלאחריהם גירוי נוסף (S2) עם מרווח ראשוני של 80 אלפיות השנייה. הפחת שוב ושוב את מרווח S2 ב-2 אלפיות השנייה בכל פעם עד שלא ניתן עוד ללכוד את פעימות הלב (כלומר, להגיע לתקופת העקשנות היעילה של הלב, ERP)13.
- עקוב אחר כל טכיאריתמיות חדריות המושרות (כולל טכיקרדיה חדרית ופרפור חדרי) על ידי אק"ג.
- אם לא מושרות הפרעות קצב על ידי ההליך הנ"ל, הוסף גירוי נוסף נוסף (S3) לאחר S2 עם אותם מרווחים ראשוניים (80 אלפיות השנייה) וגזירה (על ידי 2 אלפיות השנייה) עד להגעה ל- ERP.
- אם עדיין לא מושרות טאכיאריתמיות חדריות, הוסיפו עוד גירוי אחד נוסף (S4) לאחר S3 עם אותם מרווחים ראשוניים ומרווחים עד להגעה ל-ERP.
- אם עדיין לא מושרות טאכיאריתמיות חדריות (כצפוי בבקרה על לבבות בריאים), הפסיקו את פרוטוקול הגירוי החשמלי וחשבו שהלב אינו ניתן להשראה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאשר עוקבים אחר הפרוטוקול המתואר כאן (איור 1), לב של חולדה או עכבר מבודד פועם בקצב וביציבות במשך 4 שעות לפחות. אם התכנון הניסיוני דורש תקופה ארוכה יותר של זלוף לב, כדאי להוסיף אלבומין לתמיסת הזלוף כדי להפחית את המופע של בצקת שריר הלב לאחר זלוףארוך 14. הכללת איזופרוטארנול בתמיסת הזלוף מחקה את הפעלת מערכת העצבים הסימפתטית המתרחשת במצבים קצביים רבים כגון אוטם שריר הלב ואי ספיקת לב. במהלך הגירוי החשמלי המתוכנת, הקצב המוצלח של הלב מאומת על ידי (1) לכידת פעימות הלב ביחס של 1:1 במהלך גירויי S1 רצופים ו-(2) קומפלקס ה-QRS הממושך (או הרחב יותר) במהלך הקצב של S1 (איור 3 ואיור 4). הסיבה האחרונה היא שהלב נמצא בקצב השיא וההולכה האיטית יותר של ההפעלה ברקמות החדר מגדילה את משך הזמן המורכב של QRS.
כפי שהוכח בנתוניםשפורסמו 2,7 (איור 3 ואיור 4), הגירויים האדרנרגיים והחשמליים המשולבים האלה לא גרמו לשום טכיאריתמיות חדריות (המוגדרות כשלושה קומפלקסים של חדרים מוקדמים רצופים, PVCs) בלבבות עכברים בריאים (לבבות מסוג פרא המופעלים על ידי בושה באיור 3) או בלבבות חולדות בקרה (לבבות חולדות שהוזרקו על-ידי Ad-GFP באיור 4 ). לעומת זאת, אותו פרוטוקול גרם לטכיאריתמיות חדריות ב-77% מלבבות העכברים מסוג בר לאחר אוטם שריר הלב (איור 3B) ובשלושה מתוך ארבעה לבבות חולדות לאחר הזרקת Ad-Wnt3a (איור 4). זה מדגים את הנאמנות הגבוהה של גישה זו הגורמת להפרעות קצב חדריות.
ביטוי טרנסגני אינטרמיוקרדיאלי מוצלח לאחר הזרקת הנגיף יכול להיות מאומת על ידי רמות mRNA וחלבון מווסתות של הטרנסגן ברקמות שריר הלב שזוהו על ידי RT-PCR כמותי בזמן אמת, כתם מערבי או אימונוהיסטוכימיה. אם הנגיף מבטא גן מדווח פלואורסצנטי, כגון GFP, התמרה ויראלית מוצלחת יכולה להיות מאומתת גם בקרדיומיוציטים מבודדים, חיים, בודדים על ידי הביטוי שלהם של GFP9.
איור 1: זלוף לנגנדורף של לב חולדה מבודד. הלב נאסף מן החיה, ואת אבי העורקים הוא cannulated עם מחט 18 G קהה. המחט מחוברת למזרק 10 מ"ל מלא בתמיסת טירודה 37 מעלות צלזיוס בלחץ של 70-80 מ"מ כספית. הלב ממוקם בצלחת פלסטיק מצופה אלסטומר מסיליקון, 10 ס"מ עם החדר השמאלי פונה כלפי מעלה. אלקטרודות (צבעי אדום, ירוק ושחור) של מערכת א.ק.ג. של בעל חיים קטן ממוקמות סביב הלב על ידי החדרתן לציפוי הסיליקון אלסטומר בצלחת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: גירויים אדרנרגיים וחשמליים של לב לנגנדורף. (A) לב חולדה או עכבר מתנוסס על מערכת Langendorff כפי שמוצג באיור 1, ואיזופרוטרנול 1 μM מתווסף לתמיסת הטירודה המחלחלת כדי לעורר את הקולטנים האדרנרגיים β1 של הלב. לאחר מכן הלב מגורה בקצה על ידי שתי אלקטרודות פלטינה המחוברות לממריץ. (B) ייצוג הגירוי החשמלי המתוכנת. לקבלת פרטים, ראה שלב 2.2. הדמות שונתה באישור וואנג ואחרים 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: טכיאריתמיות חדריות המושרות בלבבות עכברים לאחר אוטם שריר הלב. (A) אק"ג ex vivo (עופרת II) המייצג גירוי חשמלי מתוכנת (PES) המושרה על-ידי טכיקרדיה חדרית (VT, המוגדרת כשלושה קומפלקסים של חדרים מוקדמים או יותר, PVCs) בלב עכבר מסוג בר (WT) (8 שבועות לאחר אוטם שריר הלב, MI) כאשר הוא מגורה עם גירוי אחד נוסף (S2) אך רק PVC אחד בודד ב-PVC ספציפי ללב לב עכבר נוקאאוט β-קטנין (KO) (8 שבועות לאחר MI) כאשר הוא מגורה עם שלושה גירויים נוספים (S4). איזופרוטארנול (1 μM) נכלל בתמיסת הטירודה המחלחלת במהלך גירוי PES. עכברי נוקאאוט β-קטנין (Ctnnb1) ספציפיים ללב נוצרו על-ידי עכברי Ctnnb1 flox/flox מתרבות צולבת (עם אקסונים 2 עד 6 פלוקסים) עם עכברי αMHC-MerCreMer. בגיל 8-12 שבועות, Ctnnb1 flox/flox;αMHC-MerCreMer+/− עכברים (KO) ומלטף Ctnnb1 flox/flox; עכברי αMHC-MerCreMer−/− (המשמשים כעכברי בקרה) קיבלו מדי יום זריקות תת-עוריות של טמוקסיפן (20 מ"ג/ק"ג/יום) במשך 5 ימים רצופים לפני שהוקצו לקבוצת MI או לקבוצת שאם. (B) סיכום של PVCs ו-VT הנגרמים על-ידי PES בלבבות WT ו-KO בשבוע אחד או 8 שבועות לאחר MI. ציון הפרעת קצב הוקצה לכל לב על פי הקריטריונים בטבלה השמאלית. ב-8 שבועות לאחר MI, VT הושרה בהצלחה ב-77% מהלבבות של WT, אך רק ב-18% מהלבבות של KO. הנתונים נותחו על ידי ANOVA דו-כיווני והשוואה של בונפרוני לאחר ההוק. קווי השגיאה מציינים שגיאת תקן (SE). הדמות מועתקת באישור וואנג ואחרים 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: טכיאריתמיות חדריות המושרות בלבבות חולדות לאחר הזרקה של נגיף המבטא Wnt3a. (A) PES גרם להפרעות קצב חדריות בלבבות של חולדות (200-250 גרם, זכר, ספראג-דאולי) ביום 4-6 לאחר הזרקה של אדנווירוס המבטא Wnt3a (Ad-Wnt3a, למטה) אך לא בלבבות שהוזרקו להם אדנו-וירוס בקרה המבטא GFP (Ad-GFP, למעלה). לבבות בודדו וחולחלו במערכת לנגנדורף. איזופרוטארנול (1 μM) נכלל בתמיסת הטירודה המחלחלת במהלך גירוי PES. אקס ויוו אק"ג נרשם ברציפות במהלך גירוי PES. שימו לב שבניסוי זה נעשה שימוש ב-11 גירויי S1 רצופים (צבע כחול). (B) סיכום המחקרים בפאנל (A): טכיקרדיה חדרית (VT) הושרה על ידי PES בשלושה מתוך ארבעה לבבות עם זריקת Ad-Wnt3a אך באף אחד מארבעת הלבבות עם בקרת Ad-GFP. הדמות מועתקת באישור Lu et al.7. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מספר שלבים הם קריטיים להצלחת הכנת הלב המבודד והמבודד של לנגנדורף. ראשית, חשוב להימנע מכל נזק ללב במהלך איסוף הלב (למשל, עקב סחיטה או חיתוך בשוגג עם המספריים). שנית, זה קריטי לשים את הלב שנאסף לתוך פתרון טירוד קר בהקדם האפשרי כי זה יעצור את פעימות הלב ולהפחית את צריכת החמצן של הלב. שלישית, אסור שהחדרת המחט לאבי העורקים תהיה עמוקה מדי – באופן אידיאלי, קצה המחט קרוב לרמת המסתם האאורטלי, כך שהלב מוחדר היטב דרך העורקים הכליליים. לבסוף, יש להסיר בועות במחט הזלוף לפני ביצוע קנולציה של אבי העורקים – בדרך כלל כדאי להפעיל את המשאבה למשך מספר שניות ממש לפני הקנולה כדי להסיר את הבועה שבקצה המחט.
לתכשיר הלב של לנגנדורף יש מספר יתרונות על פני מחקרי in vivo בבעלי חיים. ראשית, ניתן לשלוט במדויק בריכוז ובמשך הזמן של תרופות המופעלות על הלב (למשל, איזופרוטארנול, כפי שנעשה שימוש במחקר זה). שנית, הוא מאפשר גישה נוחה לאזורים השונים של הלב לצורך גירוי (למשל, קצב חשמלי בנקודת השיא בכתב יד זה) או רישום אותות פיזיולוגיים (למשל, מיפוי אופטי של רקמות החדר לאחר העמסה עם צבע רגישCa 2+ או רגיש למתח, שאינו מתואר כאן). בנוסף, ניתן למדוד בקלות את תפקוד הלב, כגון התכווצות חדרית, על ידי החדרת בלון לחדר השמאלי וחיבור הבלון למתמר לחץ8. שלישית, ניתן לחקור את התכונות הפנימיות של הלב, כגון קצב הלב והתכווצות החדרים, ללא הגורמים המסבכים במחקרי in vivo, כגון מערכת העצבים האוטונומית והורמוני הדם. עם זאת, המגבלה של הלב הנגוע בלנגנדורף היא שהוא חסר את הדיבור הצולב בין איברים או רקמות שונות in vivo15,16,17 באמצעות גורמים במחזור הדם או מערכת העצבים האוטונומית, שעשויים להיות שחקנים קריטיים בחלק מהמחקרים.
לרישום ex vivo ECG של הלב הנגוע בלנגנדורף, כפי שתואר כאן ובפרסומים הקודמים 2,6,7,9, יש יתרון של הקלטה ללא מגע ואינה מהווה הפרעה לתפקוד הלב בהשוואה לגישות אחרות כגון מיפוי אופטי, הדורש העמסה של Ca2+ -צבעים רגישים או רגישים למתח ושימוש ב-uncoupler של עירור-התכווצות כדי להפחית את תנועת הלב המכנית (כגון blebbistatin)12,18. עם זאת, למיפוי האופטי יש יתרון במתן מידע מפורט יותר על הפעילות החשמלית של הלב, כגון מקור פעימות הלב, דפוס ההפעלה של שריר הלב ומהירות ההולכה של שריר הלב.
השיטה של הזרקה ישירה של וירוס, כפי שתואר כאן, יכולה לשמש גם להעברת חומרים טיפוליים אחרים 19,20,21,22,23,24, כגון ביו-חומרים, אקסונים, mRNA שונה וקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע. להזרקת ההזרקה המודרכת על ידי הדמיית אולטרסאונד יש מספר יתרונות על פני גישת ההזרקה המסורתית המבוססת על כריתת בית החזה. ראשית, הוא פחות פולשני ומאפשר התאוששות מהירה יותר של בעלי החיים לאחר הליך ההזרקה. זה מפחית את ההשפעות הקשורות להליך על בעלי החיים (למשל, אלה הנגרמות על ידי כאבים לאחר הניתוח ודלקת ברקמת החזה כאשר נעשה שימוש בכריתת חזה פולשנית). שנית, הדמיית אולטרסאונד מאמתת הזרקת וירוס מוצלחת בלב, מה שמגביר את העקביות והשכפול של התוצאות. עם זאת, המגבלה של גישת הזרקת הנגיפים מונחית האולטרסאונד היא שלא ניתן לשלוט במיקומים של אתרי הזרקת הנגיף בצורה מדויקת כמו בגישה המבוססת על בית החזה, המאפשרת לוקליזציה חזותית של אזורי הלב השונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי הפרויקט של המכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR) (PJT-148918 ו- PJT-180533, ל- WL), פרס חוקר הקריירה המוקדמת של CIHR (AR8-162705, ל- WL), קרן הלב והשבץ של קנדה (HSFC) מלגת מקדונלד ופרס חוקר חדש (S-17-LI-0866, ל- WL), מלגות סטודנטים (ל- JW ו- YX), ומלגת פוסט-דוקטורט (ל- AL) מאוניברסיטת אוטווה קרנות הקדשת לב במכון הלב. המחברים מודים למר ריצ'רד סימור על תמיכתו הטכנית. איור 2 נוצר עם Biorender.com עם רישיונות מאושרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Wang, J., et al. Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Scientific Reports. 11 (1), 17722 (2021).
- Wang, T., et al. Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats. Physiological Reports. 7 (24), 14323 (2019).
- Lin, H. B., et al. Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance. Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).
- Karunakaran, D., et al. RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice. Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).
- Gharibeh, L., et al. GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118 (2021).
- Lu, A., et al. Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling. Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).
- Liang, W., et al. Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility. Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).
- Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies. Scientific Reports. 9 (1), 6930 (2019).
- Cingolani, E., et al. Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy. Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).
- Ionta, V., et al. SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability. Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).
- Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine. Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).
- Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).
- Hong, P., et al. NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121 (2019).
- Lin, H. B., et al. Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes. Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).
- Lin, H. B., et al. Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state. Frontiers in Immunology. 12, 737170 (2021).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Allison, S., et al. Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).
- Hamel, V., et al. De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges. Stem Cells International. 2017, 4528941 (2017).
- Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331 (2017).
- McLaughlin, S., et al. Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 4866 (2019).
- Villanueva, M., et al. Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction. Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).
- Kanda, P., et al. Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells. Biomaterials. 247, 120010 (2020).
