Summary
本协议描述了在超声心动图引导下通过直接心肌内注射病毒在大鼠和小鼠心脏中表达转基因的方法。本文还解释了通过对孤立的朗根多夫灌注的心脏进行程序性电刺激来评估心脏对室性心律失常易感性的方法。
Abstract
心脏病是全世界发病率和死亡率的主要原因。由于易于处理和丰富的转基因品系，啮齿动物已成为心血管研究的重要模型。然而，经常导致心脏病患者死亡的自发致死性心律失常在心脏病啮齿动物模型中很少见。这主要是由于人类和啮齿动物之间心脏电特性的物种差异，并对使用啮齿动物研究心律失常提出了挑战。该协议描述了一种使用超声心动图引导的重组病毒（腺病毒和腺相关病毒）肌内注射在小鼠和大鼠心室心肌中实现有效转基因表达的方法。这项工作还概述了一种方法，该方法能够使用孤立的，Langendorff灌注的小鼠和大鼠心脏以及肾上腺素能和程序性电刺激来可靠地评估心律失常的心脏易感性。这些技术对于研究与损伤后不良心脏重塑（如心肌梗塞）相关的心律失常至关重要。
Introduction
心血管疾病是全球主要死因，仅在2017年就夺走了1800万人的生命1。啮齿动物，尤其是小鼠和大鼠，由于易于处理和各种转基因过表达或敲除系的可用性，已成为心血管研究中最常用的模型。啮齿动物模型对于理解疾病机制和确定心肌梗塞2，高血压3，心力衰竭4和动脉粥样硬化5的潜在新治疗靶点至关重要。然而，与人类或大型动物模型相比，啮齿动物在心律失常研究中的使用受到其小心脏尺寸和更快心率的限制。因此，心肌梗死后小鼠或大鼠的自发致死性心律失常很少见2。研究人员被迫关注可能反映促心律失常底物的间接继发性变化，例如纤维化或基因表达，而没有显示出心律失常负担或促心律失常倾向的有意义的变化。为了克服这一限制，本协议描述了一种允许可靠评估小鼠和大鼠心脏在基因修饰6，7 或心肌梗死2 后对室性快速性心律失常的易感性的方法。该方法将肾上腺素能受体刺激与程序性电刺激相结合，以在孤立的，Langendorff灌注的8 个小鼠和大鼠心脏中诱导室性快速性心律失常。
啮齿动物心肌组织中病毒基因转移的标准方法通常涉及通过开胸术9，10，11暴露心脏，这是一种侵入性手术，与手术后动物恢复延迟有关。本文介绍了一种在超声成像引导下直接心肌注射病毒以治疗转基因过表达的方法。与开胸术相比，这种侵入性较小的手术允许动物在病毒注射后更快地恢复和更少的组织损伤，减少动物的术后疼痛和炎症，从而可以更好地评估转基因基因对心脏功能的影响。
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Protocol
所描述的所有方法和程序都得到了渥太华大学动物研究伦理审查委员会和渥太华大学心脏研究所生物安全审查委员会的批准。制定的安全规程包括，处理重组腺病毒或腺相关病毒（AAV）的所有程序均在II级生物安全柜中进行。实验结束后，所有与病毒接触的物品都进行了彻底净化。Ctnnb1 flox / flox和αMHC-MerCreMer小鼠（8-12周龄，任何性别）和Sprague-Dawley大鼠（200-250g，雄性）用于本研究。这些动物是从商业来源获得的（见材料表）。所有涉及动物的程序均由经过机构监管委员会培训和批准的工作人员执行。在所有手术过程中都使用了适当的个人防护设备。
1. 啮齿动物脑室组织中的病毒转基因表达
注意：将表达靶基因和相应对照病毒的重组腺病毒或AAV，如Ad-GFP（滴度为1 x 1010 PFU/mL）或AAV9-GFP（滴度为1 x 1013 GC/mL）（参见 材料表）储存在-80°C冰箱中。
- 在注射病毒的当天，在冰上解冻病毒。用30G 1/2针将表达靶基因和对照病毒的病毒吸出到两个单独的注射器（体积= 50μL）中，并保持在冰上直至使用。
注意：注射器和针头中的任何气泡必须小心去除。 - 向大鼠或小鼠施用丁丙诺啡（大鼠0.05mg / kg，小鼠0.1mg / kg，皮下），1小时后使用3%异氟醚诱导麻醉，并将异氟烷维持在2%（在100%氧气中，流速为0.5-1.0L / min）用于后续程序。
- 用一对镊子轻轻捏住动物的身体（例如尾巴），如果动物对捏没有任何身体动作的反应，则确认适当的麻醉。
- 使用电加热垫将体温保持在37°C。使用理发器剃掉胸部区域的头发。
注意：使用电加热垫时应小心，因为潜在的热量分布不均匀。 - 在双眼上涂抹眼药膏以防止角膜干燥。
- 保持动物仰卧位，并使用临床前成像系统（见 材料表）在短轴方向对动物的心脏进行超声成像。
注意：以下步骤在提供无菌环境的II级生物安全柜中执行。采用标准安全程序，包括安全针头处理程序。 - 用碘基或氯己定基磨砂膏和酒精交替进行三轮打圈运动，对动物的左下胸部区域进行消毒。
- 在超声成像引导下，插入步骤1.1中制备的含有病毒的注射器的30G 1/2针头。通过身体的左下胸部进入动物的胸部。
- 将针尖接近左心室前游离壁，缓慢注射10-15μL病毒。通过针尖附近的增强亮度验证超声图像中的成功注射。
注意：每个部位注射的病毒量不超过15μL，以防止对心肌组织的物理损伤。 - 从心脏中取出针头并将其插入左心室的其他区域，以进行第二次和第三次注射相同数量的病毒。
注意：注射位点的总数由实验设计确定。如果需要局灶性转基因表达，只需注射一次;如果需要更多的扩散转基因表达，通常需要多个注射位点（三到五个）。 - 注射完成后，将动物放回笼子。
- 仔细监测动物，直到它恢复足够的意识以保持胸骨卧位并将其送回其住房房间。
- 在接下来的2天里向动物施用丁丙诺啡HCl（0.1mg / kg，小鼠每天两次，0.05mg / kg，大鼠皮下每天两次）。将动物送回动物园，每天监测是否有任何异常的疼痛或痛苦迹象，如果发现，请根据机构动物护理委员会的规程对待动物。
2.心律失常易感性的评估
注意：在腺病毒注射后4-6天和AAV注射后1-2周，按照步骤2.1.-2.2评估动物心脏对心律失常的易感性。
- 对大鼠或小鼠心脏进行朗根多夫灌注。
- 通过将以下内容添加到1L水中来制备Tyrode溶液：NaCl，7.9g（最终= 135mM）;氯化钾，0.37 克（5.0 毫米）;氯化钙2， 0.27 克 （1.8 毫米）;氯化镁2， 0.24 克 （1.2 毫米）;HEPES，2.38 克（10 毫米）;和葡萄糖，1.8 克（10 毫米）。用氢氧化钠将pH调节至7.40（见 材料表）。
- 用0.2μm过滤器过滤溶液，并在步骤2.1.6.-2.2.8中连续用100%O2 鼓泡。
- 向大鼠或小鼠施用肝素（500U / kg，腹膜内注射），10分钟后用3%异氟醚麻醉动物。确保充分麻醉，轻轻捏住身体。
- 用手术刀在锁骨中线做一个1-1.5厘米的垂直切口，进行左开胸术，露出心脏。
- 用一把剪刀在主动脉弓水平切割来收集心脏，并立即将心脏放入冰冷的Tyrode溶液中。
注意：在心脏采集过程中，请注意不要损坏心脏。 - 用钝针（大鼠18G;小鼠23G）在恒定流速模式下连接到改良的Langendorff灌注系统（参见 材料表）套管心脏主动脉。调节流速以将灌注压力保持在 70-80 mmHg。
注意：灌注针中的任何气泡必须在主动脉插管前去除。使用解剖显微镜有助于插管。 - 将空心的心脏放入有机硅弹性体涂层的9，10cm塑料盘中，左心室朝上，并在37°C下用O2气泡的Tyrode溶液灌注心脏9，12。
- 通过观察前两到三次心跳期间心脏血液的冲洗以及心脏颜色从红色变为苍白的变化，验证灌注开始时正确的主动脉插管。
- 将小动物心电图系统的电极（见 材料表）插入培养皿中的有机硅弹性体涂层中，将它们放置在心脏周围（图1）。使用兼容软件记录心电图。
- 进行肾上腺素能受体刺激和程序性电刺激以诱导室性快速性心律失常。
- 主动脉插管成功后，继续用Tyrode溶液灌注心脏20分钟以稳定心脏准备。
- 在步骤2.2.3.-2.2.8中向用于心脏灌注的Tyrode溶液中加入1μM异丙肾上腺素（参见 材料表）。
- 异丙肾上腺素灌注10分钟后，用连接到电刺激器的两个铂电极刺激顶点的心脏（见 材料表）。
- 从刺激程序（图2）开始，其中包括10个连续刺激（S1，5 V，100 ms间隔），然后是初始间隔为80 ms的额外刺激（S2）。每次重复将 S2 间隔减少 2 ms，直到无法再捕获心跳（即达到心脏的有效不应期，ERP）13。
- 通过心电图监测任何诱发的室性快速性心律失常（包括室性心动过速和颤动）。
- 如果上述程序没有诱发心律失常，请在S2之后以相同的初始（80毫秒）和递减（2毫秒）间隔添加另一个额外的刺激（S3），直到达到ERP。
- 如果仍然没有诱发室性快速性心律失常，请在 S3 之后再添加一个额外的刺激 （S4），具有相同的初始和递减间隔，直到达到 ERP。
- 如果室性快速性心律失常仍未被诱发（如对照健康心脏所预期的那样），停止电刺激方案并认为心脏是不可诱导的。
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Representative Results
当按照此处描述的方案（图1）灌注时，分离的大鼠或小鼠心脏有节奏且稳定地跳动至少4小时。如果实验设计需要较长时间的心脏灌注，则在灌注液中加入白蛋白有助于减少长时间灌注后心肌水肿的发生14。在灌注溶液中加入异丙肾上腺素模仿交感神经系统的激活，这发生在许多致心律失常疾病，如心肌梗塞和心力衰竭中。在程序化的电刺激期间，通过（1）在连续的S1刺激期间1：1捕获心跳和（2）在S1起搏期间延长（或更宽）的QRS波群来验证心脏的成功起搏（图3 和 图4）。后者是因为心脏在顶点起搏，心室组织中激活的较慢传导增加了QRS波群的持续时间。
如已发表的数据2，7（图3和图4）所示，这些肾上腺素能和电刺激的组合在健康小鼠心脏（图3中的假手术野生型心脏）或对照大鼠心脏（图4中控制Ad-GFP注射的大鼠心脏）中没有引起室性快速性心律失常（定义为至少三个连续的早发性心室复合物，PVC）).相比之下，相同的方案在心肌梗死后77%的野生型小鼠心脏中诱导室性快速性心律失常（图3B）和心肌内注射Ad-Wnt3a后四分之三的大鼠心脏（图4）。这证明了这种室性心律失常诱导方法的高保真度。
病毒注射后成功的心肌内转基因表达可以通过实时定量RT-PCR、蛋白质印迹或免疫组织化学鉴定的心肌组织中转基因的上调mRNA和蛋白质水平来验证。如果病毒表达荧光报告基因，例如GFP，则还可以通过GFP9的表达在分离的活体单个心肌细胞中验证成功的病毒转导。
图1：孤立大鼠心脏的朗根多夫灌注。 从动物身上收集心脏，用钝的18G针插管主动脉。将针头连接到装有37°C Tyrode溶液的10mL注射器，压力为70-80mmHg。将心脏放置在有机硅弹性体涂层的10厘米塑料盘中，左心室朝上。将小动物心电图系统的电极（红色、绿色和黑色）插入培养皿中的有机硅弹性体涂层中，放置在心脏周围。 请点击此处查看此图的大图。
图2：朗根多夫灌注心脏的肾上腺素能和电刺激。 （A）如图1所示，将大鼠或小鼠心脏灌注到Langendorff系统上，并将1μM异丙肾上腺素醇加入灌注Tyrode溶液中以刺激心脏的β1肾上腺素能受体。然后通过连接到刺激器的两个铂电极在顶点刺激心脏。（B）程序电刺激的表示。有关详细信息，请参阅步骤 2.2。该图经Wang等人2许可修改。请点击此处查看此图的大图。
图3：心肌梗死后小鼠心脏中诱发的室性快速性心律失常。 （A）代表性离体心电图（导联II）显示程序性电刺激（PES）诱导的室性心动过速（VT，定义为三个或更多连续的室性早发性心动过速）（在心肌梗死后8周，MI）中，当受到一种额外刺激（S2）的刺激，但在心脏特异性中只有一个PVC时，野生型（WT）小鼠心脏（VT，定义为三个或更多连续的室性早发复合物，PVC） β-连环蛋白敲除（KO）小鼠心脏（在MI后8周）受到三个额外刺激（S4）的刺激。在PES刺激期间，异丙肾上腺素（1μM）包含在灌注Tyrode溶液中。通过与αMHC-MerCreMer小鼠杂交育Ctnnb1 flox/flox小鼠（具有外显子2至6个絮凝体）产生心脏特异性β连环蛋白（Ctnnb1）敲除小鼠。在8-12周龄时，Ctnnb1 flox/flox;αMHC-MerCreMer+/−小鼠（KO）和同窝伴侣Ctnnb1 flox/flox;αMHC-MerCreMer−/−小鼠（用作对照野生型小鼠）在被分配到MI或假组之前连续5天每天皮下注射他莫昔芬（20mg / kg /天）。（B）心肌梗死后1周或8周时WT和KO心脏中PES诱导的PVC和VT的总结。根据左表中的标准为每个心脏分配心律失常评分。心肌梗死后 8 周，VT 在 77% 的 WT 心脏中成功诱导，但仅在 18% 的 KO 心脏中成功诱导。通过双向方差分析和邦弗朗尼事后比较分析数据。误差线指示标准误差 （SE）。该图经王等人许可转载2。请点击此处查看此图的大图。
图4：心肌内注射表达Wnt3a的病毒后在大鼠心脏中诱导的室性快速性心律失常。 （A）PES诱导的大鼠心脏（200-250g，雄性，Sprague-Dawley）在心肌内注射表达Wnt3a的腺病毒（Ad-Wnt3a，底部）后第4-6天在大鼠心脏中引起的室性心律失常，但在注射表达GFP的对照腺病毒（Ad-GFP，顶部）的心脏中没有。心脏被隔离并灌注在朗根道夫系统上。在PES刺激期间，异丙肾上腺素（1μM）包含在灌注Tyrode溶液中。离体在PES刺激期间连续记录心电图。请注意，本实验中使用了 11 个连续的 S1 刺激（蓝色）。（B）小组（A）的研究摘要：PES在注射Ad-Wnt3a的四分之三的心脏中由PES诱导室性心动过速（VT），但在控制Ad-GFP的四颗心脏中没有一个。该图经Lu等人许可转载7。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
有几个步骤对于朗根多夫灌注的分离心脏准备的成功至关重要。首先，重要的是要避免在心脏采集过程中对心脏造成任何损害（例如，由于意外挤压或剪刀切割）。其次，尽快将收集的心脏放入冷的Tyrode溶液中至关重要，因为这会停止心跳并减少心脏的耗氧量。第三，针插入主动脉不能太深——理想情况下，针尖靠近主动脉瓣水平，以便心脏通过冠状动脉充分灌注。最后，灌注针中的气泡需要在主动脉插管之前去除——在插管前打开泵几秒钟以去除针尖的气泡通常是有帮助的。
与动物体内研究相比，Langendorff灌注的心脏制剂有几个优点。首先，可以准确控制应用于心脏的药物（例如，本研究中使用的异丙肾上腺素）的浓度和持续时间。其次，它允许轻松进入心脏的不同区域进行刺激（例如，本手稿中顶点的电起搏）或生理信号记录（例如，加载Ca2+敏感或电压敏感染料后心室组织的光学映射，此处未描述）。此外，通过将球囊插入左心室并将球囊连接到压力传感器8，可以很容易地测量心脏功能，例如心室收缩力。第三，心脏的内在特性，如心率和心室收缩力，可以在没有体内研究中复杂因素的情况下进行研究，例如自主神经系统和循环激素。然而，Langendorff灌注心脏的局限性在于它缺乏体内不同器官或组织之间的串扰 15，16，17 通过循环因子或自主神经系统，这可能是一些研究中的关键参与者。
Langendorff灌注心脏的离体ECG记录，如此处和以前的出版物2，6，7，9中所述，具有非接触式记录的优点，并且不会对心脏功能造成干扰，与其他方法（例如光学映射）相比，这需要加载Ca 2 +。-敏感或电压敏感染料和使用激发收缩解耦器来减少机械心脏运动（如布比他汀）12，18。然而，光学映射的优点是提供有关心脏电活动的更详细信息，例如心跳的起源、心肌激活的模式和心肌传导速度。
如本文所述，直接心肌内注射病毒的方法也可用于递送其它治疗材料19，20，21，22，23，24，例如生物材料、外显子、修饰的mRNA和干细胞来源的心肌细胞。与传统的开胸注射方法相比，超声成像引导下的心肌内注射具有几个优点。首先，它的侵入性较小，允许动物在注射程序后更快地恢复。这减少了对动物的手术相关影响（例如，使用侵入性开胸术时由术后疼痛和胸组织炎症引起的影响）。其次，超声成像验证了在心脏中成功注射病毒，从而提高了结果的一致性和可重复性。然而，超声引导的病毒注射方法的局限性在于，病毒注射部位的位置不能像基于开胸术的方法那样精确控制，该方法允许不同心脏区域的视觉定位。
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Disclosures
作者没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了加拿大卫生研究院（CIHR）项目资助（PJT-148918和PJT-180533，WL），CIHR早期职业研究者奖（AR8-162705，WL），加拿大心脏和中风基金会（HSFC）麦当劳奖学金和新研究者奖（S-17-LI-0866，WL），学生奖学金（JW和YX）和渥太华大学心脏研究所心脏捐赠基金的博士后奖学金（AL）的支持。作者感谢理查德·西摩先生的技术支持。 图 2 是使用 Biorender.com 批准的许可证创建的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
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