Bu protokol, ekokardiyografi rehberliğinde virüsün doğrudan intramiyokard enjeksiyonu ile sıçan ve fare kalplerinde transgen ekspresyonu yöntemlerini açıklamaktadır. İzole, Langendorff perfüze edilmiş kalplerin programlanmış elektriksel stimülasyonu ile kalplerin ventriküler aritmilere duyarlılığının değerlendirilmesi için yöntemler de burada açıklanmaktadır.
Kalp hastalığı tüm dünyada önde gelen morbidite ve mortalite nedenidir. Transgenik suşların kullanım kolaylığı ve bolluğu nedeniyle, kemirgenler kardiyovasküler araştırmalar için gerekli modeller haline gelmiştir. Bununla birlikte, kalp hastalığı hastalarında sıklıkla mortaliteye neden olan spontan ölümcül kardiyak aritmiler, kalp hastalığının kemirgen modellerinde nadirdir. Bu öncelikle insan ve kemirgenler arasındaki kardiyak elektriksel özelliklerdeki tür farklılıklarından kaynaklanmaktadır ve kemirgenleri kullanan kardiyak aritmilerin incelenmesine meydan okumaktadır. Bu protokol, rekombinant virüsün (adenovirüs ve adeno ilişkili virüs) ekokardiyografi eşliğinde intramüsküler enjeksiyonlarını kullanarak fare ve sıçan ventriküler miyokardında etkili transgen ekspresyonunu sağlamak için bir yaklaşımı açıklamaktadır. Bu çalışma aynı zamanda, hem adrenerjik hem de programlanmış elektriksel stimülasyonlarla izole edilmiş, Langendorff perfüze fare ve sıçan kalplerini kullanarak aritmilere kardiyak duyarlılığın güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlayacak bir yöntemi özetlemektedir. Bu teknikler, miyokard enfarktüsü gibi yaralanmalardan sonra olumsuz kardiyak yeniden yapılanma ile ilişkili kalp ritmi bozukluklarını incelemek için kritik öneme sahiptir.
Kardiyovasküler hastalık, dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir ve sadece 2017 yılında 18 milyon insanın hayatına mal olmuştur1. Kemirgenler, özellikle fareler ve sıçanlar, kullanım kolaylığı ve çeşitli transgenik aşırı ekspresyon veya nakavt çizgilerinin mevcudiyeti nedeniyle kardiyovasküler araştırmalarda en yaygın kullanılan model haline gelmiştir. Kemirgen modelleri, hastalık mekanizmalarını anlamak ve miyokard enfarktüsü2, hipertansiyon3, kalp yetmezliği4 ve ateroskleroz5’te potansiyel yeni terapötik hedefleri belirlemek için temel olmuştur. Bununla birlikte, kardiyak aritmiler çalışmalarında kemirgenlerin kullanımı, insan veya büyük hayvan modellerine kıyasla küçük kalp boyutları ve daha hızlı kalp atış hızları ile sınırlıdır. Bu nedenle, miyokard enfarktüsü sonrası farelerde veya sıçanlarda spontan ölümcül aritmiler nadirdir2. Araştırmacılar, aritmi yükünde veya pro-aritmik eğilimlerde anlamlı değişiklikler göstermeden, fibroz veya gen ekspresyonu gibi pro-aritmik bir substratı yansıtabilecek dolaylı ikincil değişikliklere odaklanmak zorunda kalmaktadır. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, fare ve sıçan kalplerinin genetik modifikasyon 6,7 veya miyokard enfarktüsü2 sonrası ventriküler taşiaritmilere duyarlılığının güvenilir bir şekilde değerlendirilmesini sağlayan bir yöntem mevcut protokolde tanımlanmıştır. Bu yöntem, izole edilmiş, Langendorff perfüzeedilmiş 8 fare ve sıçan kalplerinde ventriküler taşiaritmileri indüklemek için adrenerjik reseptör stimülasyonunu programlanmış elektriksel stimülasyonla birleştirir.
Kemirgen miyokard dokusunda viral gen transferi için standart yaklaşımlar genellikle kalbin torakotomi 9,10,11 ile maruz kalmasını içerir, bu da invaziv bir prosedürdür ve işlemden sonra hayvanların gecikmiş iyileşmesi ile ilişkilidir. Bu makalede, transgenlerin aşırı ekspresyonu için ultrason görüntüleme rehberliğinde doğrudan intramiyokard virüs enjeksiyonu yöntemi açıklanmaktadır. Bu daha az invaziv prosedür, torakotomi ile karşılaştırıldığında, viral enjeksiyondan sonra daha hızlı hayvan iyileşmesine ve daha az doku hasarına izin verir, hayvandaki ameliyat sonrası ağrı ve iltihabı azaltır ve böylece transgenik genlerin kalp fonksiyonu üzerindeki etkilerinin daha iyi değerlendirilmesini sağlar.
Langendorff perfüzyonlu, izole kalp preparatının başarısı için birkaç adım kritik öneme sahiptir. İlk olarak, kalp toplanması sırasında kalbe herhangi bir zarar gelmesini önlemek önemlidir (örneğin, makasla kazara sıkma veya kesme nedeniyle). İkincisi, toplanan kalbi mümkün olan en kısa sürede soğuk Tyrode çözeltisine koymak çok önemlidir, çünkü bu kalp atışını durduracak ve kalbin oksijen tüketimini azaltacaktır. Üçüncüsü, aort içine iğne yerleştirilmesi çok derin olmamalı…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CIHR) Proje Hibeleri (PJT-148918 ve PJT-180533, WL’ye), CIHR Erken Kariyer Araştırmacı Ödülü (AR8-162705, WL’ye), Kanada Kalp ve İnme Vakfı (HSFC) McDonald Bursu ve Yeni Araştırmacı Ödülü (S-17-LI-0866, WL’ye), Öğrenci Bursları (JW ve YX’e) ve Ottawa Üniversitesi Kardiyak Bağış Fonlarından Doktora Sonrası Bursu (AL’ye) tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Richard Seymour’a teknik desteği için teşekkür eder. Şekil 2 , onaylanmış lisanslara sahip Biorender.com oluşturulmuştur.
30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
Heating pad | Life Brand | E12107 | |
Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |