Viralt transgenuttryck i gnagarhjärtan och bedömning av hjärtarytmirisk
Summary
Detta protokoll beskriver metoder för transgenuttryck i rått- och mushjärtan genom direkt intramyokardiell injektion av viruset under ekokardiografivägledning. Metoder för bedömning av hjärtans mottaglighet för ventrikulära arytmier genom programmerad elektrisk stimulering av isolerade, Langendorff-perfuserade hjärtan förklaras också här.
Abstract
Hjärtsjukdomar är den främsta orsaken till sjuklighet och dödlighet över hela världen. På grund av den enkla hanteringen och överflödet av transgena stammar har gnagare blivit viktiga modeller för kardiovaskulär forskning. Spontana dödliga hjärtarytmier som ofta orsakar dödlighet hos hjärtsjukdomspatienter är dock sällsynta i gnagarmodeller av hjärtsjukdomar. Detta beror främst på artskillnaderna i hjärtelektriska egenskaper mellan människa och gnagare och utgör en utmaning för studien av hjärtarytmier med hjälp av gnagare. Detta protokoll beskriver ett tillvägagångssätt för att möjliggöra effektivt transgenuttryck i mus- och råttkammarmyokardium med hjälp av ekokardiografistyrda intramuskulära injektioner av rekombinant virus (adenovirus och adenoassocierat virus). Detta arbete beskriver också en metod för att möjliggöra tillförlitlig bedömning av hjärtkänslighet för arytmier med hjälp av isolerade, Langendorff-perfuserade mus- och råtthjärtan med både adrenerga och programmerade elektriska stimuleringar. Dessa tekniker är avgörande för att studera hjärtrytmstörningar i samband med negativ hjärtombyggnad efter skador, såsom hjärtinfarkt.
Introduction
Hjärt-kärlsjukdom är den vanligaste dödsorsaken i världen och krävde 18 miljoner människors liv bara under 20171. Gnagare, särskilt möss och råttor, har blivit den vanligaste modellen inom kardiovaskulär forskning på grund av enkel hantering och tillgången till olika transgena överuttryck eller knockout-linjer. Gnagarmodeller har varit grundläggande för att förstå sjukdomsmekanismerna och för att identifiera potentiella nya terapeutiska mål vid hjärtinfarkt2, hypertoni3, hjärtsvikt4 och åderförkalkning5. Användningen av gnagare i studier av hjärtarytmier begränsas dock av deras lilla hjärtstorlek och snabbare hjärtfrekvens jämfört med modeller för människor eller stora djur. Därför är spontana dödliga arytmier hos möss eller råttor efter hjärtinfarkt sällsynta2. Utredare tvingas fokusera på indirekta sekundära förändringar som kan återspegla ett proarytmiskt substrat, såsom fibros eller genuttryck, utan att visa meningsfulla förändringar i arytmibörda eller proarytmiska tendenser. För att övervinna denna begränsning beskrivs en metod som möjliggör en tillförlitlig bedömning av mus- och råtthjärtans mottaglighet för ventrikulära takyarytmier efter genetisk modifiering 6,7 eller hjärtinfarkt2 i detta protokoll. Denna metod kombinerar adrenerg receptorstimulering med programmerad elektrisk stimulering för att inducera ventrikulära takyarytmier i isolerade, Langendorff-perfuserade8 mus- och råtthjärtan.
Standardmetoder för viral genöverföring i gnagare myokardvävnad involverar ofta exponering av hjärtat genom torakotomi 9,10,11, vilket är ett invasivt förfarande och är förknippat med fördröjd återhämtning av djuren efter proceduren. Denna artikel beskriver en metod för direkt intramyokardiell injektion av virus under ultraljudsavbildningsvägledning för överuttryck av transgener. Detta mindre invasiva förfarande möjliggör snabbare djuråterhämtning efter viral injektion och mindre vävnadsskada, jämfört med thorakotomi, minskar postoperativ smärta och inflammation hos djuret och möjliggör därmed bättre bedömning av effekterna av transgena gener på hjärtfunktionen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flera steg är avgörande för framgången för den Langendorff-perfuserade, isolerade hjärtförberedelsen. För det första är det viktigt att undvika skador på hjärtat under hjärtuppsamling (t.ex. på grund av oavsiktlig klämning eller skärning med saxen). För det andra är det viktigt att sätta det uppsamlade hjärtat i kall tyrodlösning så snart som möjligt eftersom detta kommer att stoppa hjärtslaget och minska syreförbrukningen i hjärtat. För det tredje får nålinsättningen i aortan inte vara för…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Project Grants (PJT-148918 och PJT-180533, till WL), CIHR Early Career Investigator Award (AR8-162705, till WL), Heart and Stroke Foundation of Canada (HSFC) McDonald Scholarship och New Investigator Award (S-17-LI-0866, till WL), studentstipendier (till JW och YX) och ett postdoktoralt stipendium (till AL) från University of Ottawa Cardiac Endowment Funds vid Heart Institute. Författarna tackar Richard Seymour för hans tekniska support. Bild 2 skapades med Biorender.com med godkända licenser.
Materials
| 30 G 1/2 PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson (BD) | 305106 | |
| adeno-associated virus (AAV9-GFP) | Vector Biolabs | 7007 | |
| adenovirus (Ad-GFP) | Vector Biolabs | 1060 | |
| adenovirus (Ad-Wnt3a) | Vector Biolabs | ADV-276318 | |
| Biosafety cabinet (Level II) | Microzone Corporation | N/A | Model #: BK-2-4 |
| Buprenorphine | Vetergesic | DIN 02342510 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 102378 | |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16-1 | |
| Hair clipper | WAHL Clipper Corporation | 78001 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | 20701 | 705 LT, volume 50 μL |
| Heating pad | Life Brand | E12107 | |
| Heparin | Fresenius Kabi | DIN 02264315 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi Ltd. | M60303 | |
| Isoproterenol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 1351005 | |
| LabChart 8 software | ADInstruments Inc. | Version 8.1.5 | for ECG recording |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Mice (Ctnnb1flox/flox) | Jackson Labs | 4152 | |
| Mice (αMHC-MerCreMer) | Jackson Labs | 5650 | |
| Microscope | Leica | S9i | for Langendorff system |
| MS400 transducer | VisualSonic Inc. | N/A | |
| Ophthalmic ointment | Systane | DIN 02444062 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Pressure meter | NETECH | DigiMano 1000 | for Langendorff system |
| Pump | Cole-Parmer | UZ-77924-65 | for Langendorff system |
| Rat (Sprague-Dawley, male) | Charles River | 400 | |
| Scalpel blades | Fine Science Tools | 10010-00 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 10007-12 | |
| Silicone elastomer | Down Inc. | Sylgard 184 | for Langendorff system |
| Small animal ECG system | ADInstruments Inc. | N/A | Powerlab 8/35 and Animal Bio Amp |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | |
| Stimulator | IonOptix | MyoPacer EP | |
| VEVO3100 Preclinical Imaging System | VisualSonic Inc. | N/A |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139 (2020).
- Wang, J., et al. Cardiomyocyte-specific deletion of β-catenin protects mouse hearts from ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Scientific Reports. 11 (1), 17722 (2021).
- Wang, T., et al. Effect of exercise training on the FNDC5/BDNF pathway in spontaneously hypertensive rats. Physiological Reports. 7 (24), 14323 (2019).
- Lin, H. B., et al. Innate immune Nod1/RIP2 signaling is essential for cardiac hypertrophy but requires mitochondrial antiviral signaling protein for signal transductions and energy balance. Circulation. 142 (23), 2240-2258 (2020).
- Karunakaran, D., et al. RIPK1 expression associates with inflammation in early atherosclerosis in humans and can be therapeutically silenced to reduce NF-κB activation and atherogenesis in mice. Circulation. 143 (2), 163-177 (2021).
- Gharibeh, L., et al. GATA6 is a regulator of sinus node development and heart rhythm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (1), 2007322118 (2021).
- Lu, A., et al. Direct and indirect suppression of Scn5a gene expression mediates cardiac Na+ channel inhibition by Wnt signalling. Canadian Journal of Cardiology. 36 (4), 564-576 (2020).
- Liang, W., et al. Role of phosphoinositide 3-kinase {alpha}, protein kinase C, and L-type Ca2+ channels in mediating the complex actions of angiotensin II on mouse cardiac contractility. Hypertension. 56 (3), 422-429 (2010).
- Kapoor, N., Liang, W., Marban, E., Cho, H. C. Direct conversion of quiescent cardiomyocytes to pacemaker cells by expression of Tbx18. Nature Biotechnology. 31 (1), 54-62 (2013).
- Kim, N. K., Wolfson, D., Fernandez, N., Shin, M., Cho, H. C. A rat model of complete atrioventricular block recapitulates clinical indices of bradycardia and provides a platform to test disease-modifying therapies. Scientific Reports. 9 (1), 6930 (2019).
- Cingolani, E., et al. Gene therapy to inhibit the calcium channel beta subunit: Physiological consequences and pathophysiological effects in models of cardiac hypertrophy. Circulation Research. 101 (2), 166-175 (2007).
- Ionta, V., et al. SHOX2 overexpression favors differentiation of embryonic stem cells into cardiac pacemaker cells, improving biological pacing ability. Stem Cell Reports. 4 (1), 129-142 (2015).
- Guss, S. B., Kastor, J. A., Josephson, M. E., Schare, D. L. Human ventricular refractoriness. Effects of cycle length, pacing site and atropine. Circulation. 53 (3), 450-455 (1976).
- Segel, L. D., Ensunsa, J. L. Albumin improves stability and longevity of perfluorochemical-perfused hearts. The American Journal of Physiology. 254, 1105-1112 (1988).
- Hong, P., et al. NLRP3 inflammasome as a potential treatment in ischemic stroke concomitant with diabetes. Journal of Neuroinflammation. 16 (1), 121 (2019).
- Lin, H. B., et al. Macrophage-NLRP3 inflammasome activation exacerbates cardiac dysfunction after ischemic stroke in a mouse model of diabetes. Neuroscience Bulletin. 36 (9), 1035-1045 (2020).
- Lin, H. B., et al. Cerebral-cardiac syndrome and diabetes: Cardiac damage after ischemic stroke in diabetic state. Frontiers in Immunology. 12, 737170 (2021).
- Brack, K. E., Narang, R., Winter, J., Ng, G. A. The mechanical uncoupler blebbistatin is associated with significant electrophysiological effects in the isolated rabbit heart. Experimental Physiology. 98 (5), 1009-1027 (2013).
- Allison, S., et al. Electroconductive nanoengineered biomimetic hybrid fibers for cardiac tissue engineering. Journal of Materials Chemistry. B. 5 (13), 2402-2406 (2017).
- Hamel, V., et al. De novo human cardiac myocytes for medical research: Promises and challenges. Stem Cells International. 2017, 4528941 (2017).
- Liang, W., Lu, A., Davis, D. R. Induced pluripotent stem cell-based treatment of acquired heart block: The battle for tomorrow has begun. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 10 (5), 005331 (2017).
- McLaughlin, S., et al. Injectable human recombinant collagen matrices limit adverse remodeling and improve cardiac function after myocardial infarction. Nature Communications. 10 (1), 4866 (2019).
- Villanueva, M., et al. Glyoxalase 1 prevents chronic hyperglycemia induced heart-explant derived cell dysfunction. Theranostics. 9 (19), 5720-5730 (2019).
- Kanda, P., et al. Deterministic paracrine repair of injured myocardium using microfluidic-based cocooning of heart explant-derived cells. Biomaterials. 247, 120010 (2020).
