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Medicina

内血網膜バリア透過性を評価する ためのin vitro モデルとしての内皮細胞トランスサイトーシスアッセイ

Published: June 07, 2022
doi:
10.3791/64076
, , , , , ,
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital,Harvard Medical School

Summary

このプロトコルは、ヒト網膜微小血管内皮細胞がカベオラ媒介性細胞輸送プロセスにおいて細胞間で西洋ワサビペルオキシダーゼを輸送する能力を測定することにより、内部血液網膜バリア透過性を評価するモデルとしての in vitro 内皮細胞トランスサイトーシスアッセイを示しています。

Abstract

血液網膜関門(BRB)の機能不全は、いくつかの血管性眼疾患の病態生理に寄与し、しばしば網膜浮腫およびその後の視力喪失をもたらす。内血網膜関門(iBRB)は、主に生理的条件下での透過性が低い網膜血管内皮で構成されています。低透過性のこの特徴は、隣接する網膜微小血管内皮細胞間の低速度の傍細胞輸送、ならびにそれらを通る経細胞輸送(トランスサイトーシス)によって厳密に調節および維持される。網膜経細胞バリア透過性の評価は、健康と疾患におけるiBRBの完全性に関する基本的な洞察を提供する可能性があります。この研究では、ヒト網膜微小血管内皮細胞(HRMEC)を使用して、iBRB透過性を評価する ためのin vitro モデルとして、内皮細胞(EC)トランスサイトーシスアッセイについて説明します。このアッセイでは、受容体およびカベオラを介した経細胞輸送プロセスにおいてトランスフェリンおよび西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)をそれぞれ輸送するHRMECの能力を評価します。多孔質膜上で培養した完全にコンフルエントなHRMECを、蛍光タグ付きトランスフェリン(クラスリン依存性トランスサイトーシス)またはHRP(カベオラ媒介性トランスサイトーシス)とともにインキュベートし、EC単層全体のトランスサイトーシスレベルを示す、底部チャンバーに転写されたトランスフェリンまたはHRPのレベルを測定しました。iBRBを調節する既知の経路であるWntシグナル伝達を調節して、カベオラを介したHRPベースのトランスサイトーシスアッセイ法を実証しました。ここで説明するECトランスサイトーシスアッセイは、血管病理におけるEC透過性およびiBRB完全性の分子調節因子を調査するための有用なツールを提供し、薬物送達システムをスクリーニングするための有用なツールを提供する可能性がある。

Introduction

人間の網膜は、体内で最もエネルギーを要求する組織の1つです。神経網膜が適切に機能するためには、血液網膜関門(BRB)を介して媒介される網膜環境を保護するために、酸素と栄養素の効率的な供給と、他の潜在的に有害な分子の制限されたフラックスが必要です1。中枢神経系の血液脳関門(BBB)と同様に、BRBは眼の選択的障壁として機能し、網膜に出入りするイオン、水、アミノ酸、糖の動きを調節します。BRBはまた、免疫細胞、抗体、有害な病原体などの循環因子への曝露を防ぐことにより、網膜の恒常性とその免疫特権を維持します2。BRB機能障害は、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症(AMD)、未熟児網膜症(ROP)、網膜静脈閉塞症、ブドウ膜炎などのいくつかの血管眼疾患の病態生理に寄与し、血管原性浮腫とその後の視力喪失をもたらします3,4,5。

BRBは、網膜血管系と網膜下の開窓脈絡毛細血管という2つの異なる眼血管ネットワークに対する2つの別々の障壁で構成されています。内側BRB(iBRB)は、主に網膜微小血管系の内側を覆う網膜微小血管内皮細胞(RMEC)で構成され、網膜内神経層に栄養を与えます。一方、網膜色素上皮は、神経感覚網膜と絨毛毛細血管の間にある外側BRBの主要成分を形成しています2。iBRBの場合、RMEC間の分子輸送は、傍細胞経路と経細胞経路の両方を介して行われます(図1)。iBRB全体の高度な物質選択性は、(i)隣接する内皮細胞(EC)間の傍細胞輸送を制限する接合タンパク質複合体の存在、および(ii)低い細胞輸送速度を維持する内皮細胞内のカベオラメディエーター、トランスポーター、および受容体の発現レベルが低いことに依存しています1,6,7,8 .傍細胞フラックスを調節する接合複合体は、タイトジャンクション(クローディン、オクルジン)、アドヘレンスジャンクション(VEカドヘリン)、ギャップジャンクション(コネキシン)で構成されており、水と小さな水溶性化合物の通過を可能にします。小さな親油性分子はRMECの内部を受動的に拡散しますが、より大きな親油性分子と親水性分子の動きは、小胞輸送体や膜輸送体を含むATP駆動の経内皮経路によって調節されています5,9。

水疱性トランスサイトーシスは、カベオリン媒介性カベオラトランスサイトーシス、クラスリン依存性(および受容体媒介性)トランスサイトーシス、およびクラスリン非依存性マクロピノサイトーシスに分類できます(図2)。これらの小胞輸送プロセスにはさまざまなサイズの小胞が含まれ、マクロピノソームが最大(200〜500 nmの範囲)、カベオラが最小(平均50〜100 nm)であり、クラスリンコーティングされた小胞の範囲は70〜150 nm 10です。カベオラは、主にカベオリン足場ドメインを介して脂質膜コレステロールおよび他の構造およびシグナル伝達タンパク質に結合するカベオリン-1で構成される、タンパク質コートを備えたフラスコ型の脂質に富む原形質膜陥入です11。カベオリンは、末梢に付着したキャビンと一緒に働き、原形質膜12におけるカベオラ安定化を促進する。カベオラ膜はまた、インスリン、アルブミン、および高密度リポタンパク質(HDL)および低密度リポタンパク質(LDL)を含む循環リポタンパク質などの他の分子に対する受容体を担持して、内皮細胞を横切るそれらの移動を補助し得る13。発生中、機能的BRBの形成はECトランスサイトーシスの抑制に依存する8。したがって、成熟網膜内皮は、生理学的条件下で他の内皮細胞と比較して、カベオラ、カベオリン-1、およびアルブミン受容体のレベルが比較的低く、そのバリア特性に寄与しています4,9。

iBRBの分解は多くの眼疾患の大きな特徴であるため、網膜血管透過性をin vivoおよびin vitroで評価する方法を開発することが不可欠です。これらの方法は、BRBの完全性の低下のメカニズムに関する可能性のある洞察を提供し、潜在的な治療標的の有効性を評価するのに役立ちます。現在のin vivoイメージングまたは定量的血管漏出アッセイは、典型的には、蛍光(フルオレセインナトリウムおよびデキストラン)、比色(Evans Blue色素および西洋ワサビペルオキシダーゼ[HRP]基質)、または放射性トレーサー14を使用して、顕微鏡イメージングまたは単離された組織ライセート中の血管系から周囲の網膜組織への血管外漏出を検出する。血管の完全性を定量化するための理想的なトレーサーは、不活性で、健康で無傷の毛細血管内に閉じ込められた状態で、侵害された血管に自由に浸透するのに十分な大きさである必要があります。フルオレセインナトリウムまたはフルオレセインイソチオシアネート結合デキストラン(FITC-デキストラン)を生眼底フルオレセイン血管造影(FFA)または単離された網膜フラットマウントに使用する方法は、インビボまたはex vivoでの網膜血管外漏出の定量に広く使用されています。FITCデキストランには、サイズ選択的研究用に4〜70 kDaの範囲の異なる分子量で利用できるという利点があります15,16,17。FITCアルブミン(~68 kDa)は、血管漏出研究に生物学的に関連する代替の大型タンパク質トレーサーです18。心臓内19、眼窩後、または尾静脈20を通して注入されたEvans Blue色素も、内因性アルブミンとの結合に依存して、主に分光光度検出またはあまり一般的ではないがフラットマウント20,21の蛍光顕微鏡によって定量できる大きな分子を形成します。しかしながら、これらの定量的または光イメージング方法論は、しばしば傍細胞輸送と経内皮輸送を区別しない。トランスサイトーシス小胞の微細構造可視化によるトランスサイトーシスの特異的解析のために、HRPなどのトレーサー分子が典型的に使用され、電子顕微鏡下で観察できる内皮細胞内のトランスサイトーシス小胞の位置を特定する22,23,24(図3A-C)。

内皮細胞透過性を評価するためのin vitro iBRBモデルの開発と使用は、in vivo実験を補完し、血管漏出の分子調節因子の研究を支援するための堅牢でハイスループットな評価を提供する可能性があります。タイトジャンクションの傍細胞輸送と完全性を評価するために一般的に使用されるアッセイには、経内皮電気抵抗(TEER)、イオンコンダクタンスの測定値(図4)2,25、および低分子量蛍光トレーサー26を使用したin vitro血管漏出アッセイが含まれます。加えて、BBBをモデル化するトランスフェリンベースのトランスサイトーシスアッセイは、クラスリン依存性トランスサイトーシスを探索するために利用されている27。それにもかかわらず、BRB、より具体的には、インビトロでの網膜ECカベオラートランスサイトーシスを評価するアッセイは限られている。

本研究では、ヒト網膜微小血管内皮細胞(HRMEC)を in vitro モデルとして使用して、iBRB透過性とECトランスサイトーシスを決定するECトランスサイトーシスアッセイについて説明します。このアッセイは、受容体媒介性またはカベオラ依存性トランスサイトーシス経路を介してトランスフェリンまたはHRPを輸送するHRMECの能力に依存しています(図2)。頂端チャンバー(すなわち、フィルターインサート)で完全にコンフルエントになるまで培養したHRMECを蛍光結合トランスフェリン(Cy3-Tf)またはHRPとともにインキュベートし、ECトランスサイトーシスのみを介してボトムチャンバーに転写されたトランスフェリンまたはHRPのレベルに対応する蛍光強度を測定しました。細胞単層のコンフルエンシーは、TEERを測定することにより確認することができ、タイトジャンクション完全性を示す図25。TEERおよびトランスサイトーシスアッセイ技術を実証するために、血管内皮増殖因子(VEGF)28 およびWntシグナル伝達におけるもの(Wntリガンド:Wnt3aおよびNorrin)29を含む、血管透過性およびECトランスサイトーシスの既知の分子調節因子が使用されました。

Protocol

すべての動物実験は、ボストン小児病院の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって、光学顕微鏡とEM画像の生成について承認されました(図3)。 インビボ 研究のためのプロトコルは、Wangら24から得ることができる。ヒト網膜微小血管内皮細胞(HRMEC)を含むすべての実験は、ボストン小児病院の施設内バイオセーフティ委員会(IBC)によって承認され?…

Representative Results

網膜血管内皮のEM画像は、in vivoの内皮細胞における経サイトーシス小胞輸送およびカベオラ小胞を示す。ECトランスサイトーシスは、光学顕微鏡下でHRP含有血管を反射する暗褐色の沈殿物を有する網膜断面内でin vivoで視覚化することができ(図3A)、透過型電子顕微鏡(TEM)を用いてHRP含有トランスサイトーシス小胞を示す電子密度の高い沈殿…

Discussion

BRBは網膜の健康と病気に不可欠な役割を果たしています。血管透過性を評価するin vitro技術は、バリア(BRB / BBB)の発生と機能に関する研究において重要なツールであることが証明されています。ここで説明する手順は、ECトランスサイトーシスの根底にある分子メカニズムを研究したり、BRB透過性に影響を与える関連する分子調節因子を評価したりするために利用できます。インビト…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作業は、JCへのNIH助成金(R01 EY028100、EY024963、およびEY031765)によってサポートされました。ZWは、テンプル騎士団アイ財団キャリアスターターグラントによってサポートされました。

Materials

Biological Safety Cabinet  Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 1286
Cell culture petridish  Nest Biotechnology 704001
Centrifuge  Eppendorf 5702
Centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc. 352097
Centrifuge tubes (50 mL) Denville Scientific Inc. C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin  Jackson ImmunoResearch AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza Bioscience CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements Lonza Bioscience CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) Millipore MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS) Lonza Bioscience CC-4102B
Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Hemocytometer (2-chip) Bulldog Bio DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) Cell Systems ACBRI 181
Incubator Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 3110
L cells (for Control-conditioned medium) ATCC CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) ATCC CRL-2647
Light microscope Leica DMi1
Multimode Plate Reader EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) GIBCO 10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit Thermo Fisher Scientific 15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin) R&D Systems 3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) R&D Systems 293-VE
Syringe filter (0.22 µm) Millipore SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) Corning Inc. CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) GIBCO 25-200-072
Water bath Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) Selleckchem S1180
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Referências

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Keywords: Endothelial Cell Transcytosis AssayIn Vitro ModelBlood-retinal Barrier PermeabilityVascular BiologyEye ResearchBrain ResearchBlood-brain BarrierTEER MeasurementCell CultureHuman Retinal Microvascular Endothelial CellsHRMECsCell SeedingCell Culture Filter InsertsGelatin Coating
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Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F., Maurya, M., Blomfield, A. K., Tomita, Y., Chen, J. Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability. J. Vis. Exp. (184), e64076, doi:10.3791/64076 (2022).
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