בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל כמודל In vitro להערכת חדירות מחסום הרשתית הפנימית בדם
Summary
פרוטוקול זה מדגים בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל במבחנה כמודל להערכת חדירות מחסום הדם-רשתית הפנימית על ידי מדידת יכולתם של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית האנושית להעביר פרוקסידאז חזרת על פני תאים בתהליכי הובלה טרנס-תאיים בתיווך caveolae.
Abstract
תפקוד לקוי של מחסום הדם-רשתית (BRB) תורם לפתופיזיולוגיה של מספר מחלות עיניים וסקולריות, שלעתים קרובות גורמות לבצקת רשתית ולאובדן ראייה לאחר מכן. מחסום הדם-רשתית הפנימי (iBRB) מורכב בעיקר מאנדותל כלי דם ברשתית עם חדירות נמוכה בתנאים פיזיולוגיים. תכונה זו של חדירות נמוכה מווסתת היטב ומתוחזקת על ידי שיעורים נמוכים של הובלה פארא-תאית בין תאי אנדותל מיקרווסקולריים ברשתית סמוכים, כמו גם הובלה טרנס-תאית (טרנסציטוזה) דרכם. הערכת חדירות המחסום הטרנס-תאי ברשתית עשויה לספק תובנות בסיסיות לגבי שלמות ה-iBRB בבריאות ובמחלות. במחקר זה אנו מתארים בדיקת טרנסציטוזה של תאי אנדותל (EC), כמודל חוץ גופי להערכת חדירות iBRB, תוך שימוש בתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית אנושית (HRMECs). בדיקה זו מעריכה את יכולתם של HRMECs להעביר טרנספרין ופרוקסידאז חזרת (HRP) בתהליכי הובלה טרנס-תאיים בתיווך קולטן וקאוולה, בהתאמה. HRMECs בעלי השפעה מלאה שגודלו בתרבית על ממברנה נקבובית הודגמו עם טרנספרין מתויג פלואורסצנטי (טרנסציטוזה תלוית קלתרין) או HRP (טרנסציטוזה בתיווך caveolae) כדי למדוד את רמות הטרנספרין או HRP שהועברו לתא התחתון, מה שמעיד על רמות טרנסציטוזה על פני המונולייר EC. איתות WNT, מסלול ידוע המווסת את iBRB, הונע כדי להדגים את שיטת הבדיקה הטרנסציטוזה המבוססת על HRP בתיווך caveolae. בדיקת הטרנסציטוזה של EC המתוארת כאן עשויה לספק כלי שימושי לחקר הרגולטורים המולקולריים של חדירות EC ותקינות iBRB בפאתולוגיות וסקולריות ולסינון מערכות אספקת תרופות.
Introduction
הרשתית האנושית היא אחת הרקמות הדורשות אנרגיה הגבוהה ביותר בגוף. תפקוד תקין של הרשתית העצבית דורש אספקה יעילה של חמצן וחומרים מזינים יחד עם שטף מוגבל של מולקולות אחרות שעלולות להזיק כדי להגן על סביבת הרשתית, המתווכת דרך מחסום הדם-רשתית (BRB)1. בדומה למחסום הדם-מוח (BBB) במערכת העצבים המרכזית, ה-BRB פועל כמחסום סלקטיבי בעין, המווסת את תנועת היונים, המים, חומצות האמינו והסוכר אל הרשתית וממנה. BRB גם שומר על הומאוסטזיס ברשתית ועל הפריבילגיה החיסונית שלו על ידי מניעת חשיפה לגורמים במחזור הדם כגון תאי מערכת החיסון, נוגדנים ופתוגנים מזיקים2. תפקוד לקוי של BRB תורם לפתופיזיולוגיה של מספר מחלות עיניים וסקולריות, כגון רטינופתיה סוכרתית, ניוון מקולרי תלוי גיל (AMD), רטינופתיה של פגות (ROP), חסימת ורידים ברשתית ואובאיטיס, וכתוצאה מכך בצקת וזוגנית ואובדן ראייהלאחר מכן 3,4,5.
ה-BRB מורכב משני מחסומים נפרדים עבור שתי רשתות כלי דם עיניים נפרדות, בהתאמה: כלי הדם ברשתית והכוריוקפילריס הפנסטרטיבי שמתחת לרשתית. ה-BRB הפנימי (iBRB) מורכב בעיקר מתאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית (RMECs) המרפדים את המיקרו-ווסקולטורה של הרשתית, המזינים את השכבות העצביות הפנימיות ברשתית. מצד שני, אפיתל פיגמנט הרשתית מהווה את המרכיב העיקרי של BRB החיצוני, אשר נמצא בין הרשתית neurosensory ו choriocapillaris2. עבור ה-iBRB, ההובלה המולקולרית על פני RMECs מתבצעת דרך נתיבים על-תאיים וטרנס-תאיים כאחד (איור 1). הרמה הגבוהה של סלקטיביות החומר ב-iBRB מסתמכת על (i) נוכחותם של קומפלקסים של חלבונים צומתיים המגבילים את ההובלה העל-תאית בין תאי אנדותל סמוכים (ECs), ו-(ii) רמות ביטוי נמוכות של מתווכים, מובילים וקולטנים של caveolae בתוך תאי האנדותל השומרים על שיעורים נמוכים של הובלה טרנס-תאית 1,6,7,8 . קומפלקסים צמתים המווסתים את השטף הפארא-תאי מורכבים מצמתים הדוקים (קלודינים, occludins), צמתים דבקים (VE cadherins) וצמתי פער (connexins), המאפשרים מעבר של מים ותרכובות קטנות המסיסות במים. בעוד שמולקולות ליפופיליות קטנות מתפזרות באופן פסיבי על פני פנים ה-RMECs, התנועה של מולקולות ליפופיליות והידרופיליות גדולות יותר מווסתת על ידי מסלולים טרנס-אנדותליים מונעי ATP, כולל הובלה שלפוחיתית ומובילי ממברנות 5,9.
טרנסציטוזה שלפוחיתית עשויה להיות מסווגת כטרנסציטוזה מערות בתיווך קייבולין, טרנסציטוזה תלוית קלתרין (ובתיווך קולטן) ומקרופינוציטוזה שאינה תלויה בקלתרין (איור 2). תהליכי הובלה שלפוחיתיים אלה כוללים בועיות בגדלים שונים, כאשר המקרופינוזומים הם הגדולים ביותר (הנעים בין 200-500 ננומטר) ו-caveolae הם הקטנים ביותר (ממוצע של 50-100 ננומטר), בעוד ששלפוחיות מצופות קלתרין נעות בין 70-150 ננומטר10. Caveolae הם אינווגינציות של קרום פלזמה עשיר בשומנים בצורת בקבוקון עם ציפוי חלבון, המורכב בעיקר מ- caveolin-1 הקושר כולסטרול של קרום השומנים וחלבונים מבניים ואיתותים אחרים באמצעות תחום פיגומי המערותשלהם 11. Caveolins פועלים יחד עם cavin מחובר היקפית כדי לקדם ייצוב caveolae בקרום פלזמה12. ממברנות מערות עשויות גם לשאת קולטנים למולקולות אחרות כגון אינסולין, אלבומין וליפופרוטאינים במחזור, כולל ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה (HDL) וליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) כדי לסייע לתנועתם על פני תאי האנדותל13. במהלך הפיתוח, היווצרות של BRB פונקציונלי תלוי דיכוי של EC transcytosis8. אנדותל רשתית בוגר, לפיכך, יש רמות נמוכות יחסית של קולטני caveolae, caveolin-1, ו albumin ביחס לתאי אנדותל אחרים בתנאים פיזיולוגיים, תורם תכונות המחסום שלה 4,9.
מכיוון שהתמוטטות iBRB היא סימן היכר מרכזי של מחלות עיניים פתולוגיות רבות, חיוני לפתח שיטות להערכת חדירות כלי הדם ברשתית in vivo ו– in vitro. שיטות אלה מסייעות לספק תובנות סבירות לגבי המנגנונים של שלמות BRB שנפגעה ולהעריך את היעילות של מטרות טיפוליות פוטנציאליות. הדמיית in vivo נוכחית או בדיקות דליפת כלי דם כמותיות משתמשות בדרך כלל בפלואורסצנט (נתרן פלואורסצין ודקסטרון), קולורימטרי (צבע כחול אוונס ומצע פרוקסידאז חזרת [HRP]), או עוקבים רדיואקטיביים14 כדי לזהות אקסטרווזיה מכלי הדם לרקמות הרשתית הסובבות באמצעות הדמיית מיקרוסקופ או בליזאט רקמה מבודדת. עקיבה אידיאלית לכימות שלמות כלי הדם צריכה להיות אינרטית וגדולה מספיק כדי לחדור באופן חופשי לכלי דם פגועים בעודם כלואים בתוך נימים בריאים ושלמים. שיטות המשתמשות בנתרן פלואורסצין או פלואורסצין איזותיוציאנט מצומד דקסטרן (FITC-dextran) באנגיוגרפיה חיה של פונדוס פלואורסצין (FFA) או בתושבות שטוחות רשתית מבודדות נמצאות בשימוש נרחב לכמותית של אקסטרוואסציה ברשתית in vivo או ex vivo. ל-FITC-dextran יש את היתרון בכך שהוא זמין במשקלים מולקולריים שונים הנעים בין 4-70 kDa למחקרים סלקטיביים בגודל15,16,17. FITC-אלבומין (~68 kDa) הוא מעקב חלבוני חלופי בגודל גדול בעל רלוונטיות ביולוגית למחקרי דליפת כלי דם18. הצבע הכחול של אוונס, שהוזרק באופן תוך-קרדיאלי19, רטרו-אורביטלי, או דרך וריד הזנב 20, מסתמך גם על קשירתו עם אלבומין אנדוגני כדי ליצור מולקולה גדולה שניתן לכמת על ידי זיהוי ספקטרופוטומטרי בעיקר, או, פחות נפוץ, מיקרוסקופיה פלואורסצנטיתב-20,21 תושבות שטוחות. עם זאת, מתודולוגיות הדמיה כמותיות או קלות אלה אינן מבחינות לעתים קרובות בין הובלה פארא-תאית לבין הובלה טרנס-אנדותל. לצורך ניתוח ספציפי של טרנסציטוזה עם הדמיה אולטרה-סטרוקטורלית של שלפוחיות טרנסציטוזיות, מולקולות עקיבה כגון HRP משמשות בדרך כלל לאיתור שלפוחיות טרנסציטוזה בתוך תאי אנדותל שניתן לצפות בהן תחת מיקרוסקופ אלקטרונים22,23,24 (איור 3A-C).
הפיתוח והשימוש במודלים של iBRB במבחנה להערכת חדירות תאי האנדותל יכולים לספק הערכת תפוקה חזקה וגבוהה כדי להשלים ניסויי in vivo ולסייע בחקירת הרגולטורים המולקולריים של דליפת כלי דם. מבחנים נפוצים להערכת ההובלה העל-תאית והשלמות של צמתים הדוקים כוללים התנגדות חשמלית טרנס-אנדותל (TEER), מידה של מוליכות יונית (איור 4)2,25, ובדיקת דליפת כלי דם במבחנה באמצעות עוקבים פלואורסצנטיים במשקל מולקולרי קטן 26. בנוסף, מבחני טרנסציטוזה מבוססי טרנסציטוזה המבוססים על טרנספירין מודלים BBB שימשו לחקר טרנסציטוזה תלוית קלתרין27. למרות זאת, בדיקות להערכת BRB, וליתר דיוק, רשתית EC caveolar transcytosis במבחנה מוגבלים.
במחקר זה, אנו מתארים בדיקת טרנסציטוזה של EC באמצעות תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ברשתית אנושית (HRMECs) כמודל במבחנה לקביעת חדירות iBRB וטרנסציטוזה של EC. בדיקה זו מסתמכת על היכולת של HRMECs להעביר טרנספרין או HRP דרך מסלולי טרנסציטוזה בתיווך קולטן או תלויי מערות, בהתאמה (איור 2). HRMECs שגודלו בתרבית למפגש מלא בתא האפיקלי (כלומר, תוסף מסנן) דוגרו עם טרנספרין מצומד-פלואורסצנטי (Cy3-Tf) או HRP כדי למדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות המתאימה לרמות הטרנספרין או HRP שהועברו לתא התחתון באמצעות טרנסציטוזה EC בלבד. מפגש של מונולאייר התא יכול להיות מאושר על ידי מדידת TEER, המציין את שלמות הצומת הדוק25. כדי להדגים את טכניקת הבדיקה של TEER וטרנסציטוזה, נעשה שימוש במודולטורים מולקולריים ידועים של חדירות כלי דם וטרנסציטוזה של EC, כולל גורם גדילה אנדותל וסקולרי (VEGF)28 ואלה באיתות Wnt (ליגנדות Wnt: Wnt3a ונורין)29.
Protocol
Representative Results
Discussion
BRB ממלא תפקיד חיוני בבריאות הרשתית ובמחלותיה. טכניקות במבחנה להערכת חדירות כלי הדם הוכיחו את עצמן ככלים חיוניים במחקרים הנוגעים להתפתחות ותפקוד של מחסומים (BRB/BBB). ההליך המתואר כאן יכול לשמש כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס טרנסציטוזה של EC או להעריך מודולטורים מולקולר…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH (R01 EY028100, EY024963 ו- EY031765) ל- JC. ZW נתמך על ידי מענק קריירה של קרן האבירים הטמפלרים.
Materials
| Biological Safety Cabinet | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 1286 | |
| Cell culture petridish | Nest Biotechnology | 704001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc. | 352097 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| Cyanine 3-human Transferrin | Jackson ImmunoResearch | AB_2337082 | |
| Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza Bioscience | CC-3156 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements | Lonza Bioscience | CC-4176 | |
| EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) | Millipore | MERS00002 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Lonza Bioscience | CC-4102B | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Hemocytometer (2-chip) | Bulldog Bio | DHC-N002 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8250 | |
| Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) | Cell Systems | ACBRI 181 | |
| Incubator | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 3110 | |
| L cells (for Control-conditioned medium) | ATCC | CRL-2648 | |
| L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 | |
| Light microscope | Leica | DMi1 | |
| Multimode Plate Reader | EnSight, PerkinElmer | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) | GIBCO | 10010-023 | |
| QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit | Thermo Fisher Scientific | 15169 | |
| Recombinant human Norrin (rhNorrin) | R&D Systems | 3014-NR | |
| Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) | R&D Systems | 293-VE | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Millipore | SLGP033RS | |
| Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) | Corning Inc. | CLS3470-48EA | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) | GIBCO | 25-200-072 | |
| Water bath | Precision, Thermo Fisher Scientific | 51221060 | |
| XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) | Selleckchem | S1180 |
Referências
- Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
- Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
- Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
- Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
- Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877 (2021).
- Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211 (2019).
- Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
- Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
- Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
- De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
- Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
- Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
- Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , 75-107 (2006).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, 440-446 (1991).
- Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
- Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903 (2021).
- Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
- Honeycutt, S. E., O’Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
- Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154 (2020).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
- Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
- Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
- Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
- Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
- Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
- Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
- Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188 (2020).
- Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
- Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953 (2017).
- Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
- Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
- Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
- Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
- Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
- Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
- Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
- Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
- Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
- Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
- Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
- Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
- Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
- Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
- Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019 (2018).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148 (2022).
