JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Medicina

Endotelcelletranscytoseanalyse som en in vitro-model til evaluering af indre blod-retinal barrierepermeabilitet

Published: June 07, 2022
doi:
10.3791/64076
, , , , , ,
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital,Harvard Medical School

Summary

Denne protokol illustrerer et in vitro endotelcelletranscytoseassay som en model til evaluering af indre blod-retinal barrierepermeabilitet ved at måle evnen hos humane retinale mikrovaskulære endotelceller til at transportere peberrodsperoxidase på tværs af celler i caveolae-medierede transcellulære transportprocesser.

Abstract

Dysfunktion af blod-retinal barrieren (BRB) bidrager til patofysiologien af flere vaskulære øjenlidelser, hvilket ofte resulterer i retinalt ødem og efterfølgende synstab. Den indre blod-retinale barriere (iBRB) består hovedsageligt af retinal vaskulært endotel med lav permeabilitet under fysiologiske forhold. Denne funktion af lav permeabilitet er tæt reguleret og opretholdes af lave paracellulære transporthastigheder mellem tilstødende retinale mikrovaskulære endotelceller såvel som transcellulær transport (transcytose) gennem dem. Vurderingen af retinal transcellulær barrierepermeabilitet kan give grundlæggende indsigt i iBRB-integritet i sundhed og sygdom. I denne undersøgelse beskriver vi et endotelcelle (EC) transcytoseassay som en in vitro-model til evaluering af iBRB-permeabilitet ved hjælp af humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMEC’er). Dette assay vurderer HRMEC’ers evne til at transportere transferrin og peberrodsperoxidase (HRP) i henholdsvis receptor- og caveolae-medierede transcellulære transportprocesser. Fuldt sammenflydende HRMEC’er dyrket på porøs membran blev inkuberet med fluorescerende mærket transferrin (clathrinafhængig transcytose) eller HRP (caveolae-medieret transcytose) for at måle niveauerne af transferrin eller HRP overført til det nederste kammer, hvilket indikerer transcytoseniveauer på tværs af EF-monolaget. Wnt-signalering, en kendt vej, der regulerer iBRB, blev moduleret for at demonstrere den caveolae-medierede HRP-baserede transcytoseanalysemetode. Det her beskrevne EC-transcytoseassay kan være et nyttigt værktøj til at undersøge de molekylære regulatorer af EC-permeabilitet og iBRB-integritet i vaskulære patologier og til screening af lægemiddelafgivelsessystemer.

Introduction

Den menneskelige nethinde er et af de højeste energikrævende væv i kroppen. Korrekt funktion af den neurale nethinde kræver en effektiv tilførsel af ilt og næringsstoffer sammen med en begrænset flux af andre potentielt skadelige molekyler for at beskytte retinalmiljøet, som medieres via blod-retinal barrieren (BRB)1. I lighed med blod-hjerne-barrieren (BBB) i centralnervesystemet fungerer BRB som en selektiv barriere i øjet, der regulerer bevægelsen af ioner, vand, aminosyrer og sukker ind og ud af nethinden. BRB opretholder også retinal homeostase og dets immunprivilegium ved at forhindre eksponering for kredsløbsfaktorer såsom immunceller, antistoffer og skadelige patogener2. BRB-dysfunktion bidrager til patofysiologien af flere vaskulære øjenlidelser, såsom diabetisk retinopati, aldersrelateret makuladegeneration (AMD), præmatur retinopati (ROP), retinal veneokklusion og uveitis, hvilket resulterer i vasogent ødem og efterfølgende synstab 3,4,5.

BRB består af to separate barrierer for henholdsvis to forskellige okulære vaskulære netværk: retinal vaskulaturen og den fenestrerede choriocapillaris under nethinden. Den indre BRB (iBRB) består primært af retinale mikrovaskulære endotelceller (RMEC’er), der forer retinal mikrovaskulaturen, som nærer de indre retinale neuronale lag. På den anden side udgør retinal pigmentepitel hovedkomponenten i den ydre BRB, som ligger mellem den neurosensoriske nethinde og choriocapillaris2. For iBRB finder molekylær transport på tværs af RMEC’er sted gennem både paracellulære og transcellulære ruter (figur 1). Den høje grad af stofselektivitet på tværs af iBRB er afhængig af (i) tilstedeværelsen af junctionale proteinkomplekser, der begrænser paracellulær transport mellem tilstødende endotelceller (EC’er) og (ii) lave ekspressionsniveauer af caveolae-mediatorer, transportører og receptorer inden for endotelcellerne, der opretholder lave transcellulære transporthastigheder 1,6,7,8 . Junctional komplekser, der regulerer paracellulær flux, består af tætte kryds (claudiner, occludins), klæbende kryds (VE-cadheriner) og mellemrumskryds (forbindelsesforbindelser), der tillader passage af vand og små vandopløselige forbindelser. Mens små lipofile molekyler passivt diffunderer over det indre af RMEC’er, reguleres bevægelsen af større lipofile og hydrofile molekyler af ATP-drevne transendotelveje, herunder vesikulær transport og membrantransportører 5,9.

Vesikulær transcytose kan kategoriseres som caveolin-medieret caveolær transcytose, clathrinafhængig (og receptormedieret) transcytose og clathrin-uafhængig makropinocytose (figur 2). Disse vesikulære transportprocesser involverer blærer af forskellig størrelse, hvor makropinosomer er de største (fra 200-500 nm) og caveolae er den mindste (i gennemsnit 50-100 nm), mens clathrin-belagte vesikler spænder fra 70-150 nm10. Caveolae er kolbeformede lipidrige plasmamembraninvaginationer med en proteincoat, primært sammensat af caveolin-1, der binder lipidmembrankolesterol og andre strukturelle og signalproteiner via deres caveolin-stilladsdomæne11. Caveolins arbejder sammen med perifert fastgjort cavin for at fremme caveolae stabilisering ved plasmamembranen12. Caveolar membraner kan også bære receptorer for andre molekyler såsom insulin, albumin og cirkulerende lipoproteiner, herunder high-density lipoprotein (HDL) og low-density lipoprotein (LDL) for at hjælpe deres bevægelse på tværs af endotelceller13. Under udviklingen afhænger dannelsen af funktionel BRB af undertrykkelsen af EC transcytose8. Modent retinalt endotel har derfor relativt lave niveauer af caveolae-, caveolin-1- og albuminreceptorer i forhold til andre endotelceller under fysiologiske forhold, hvilket bidrager til dets barriereegenskaber 4,9.

Fordi iBRB-nedbrydning er et vigtigt kendetegn for mange patologiske øjenlidelser, er det vigtigt at udvikle metoder til vurdering af retinal vaskulær permeabilitet in vivo og in vitro. Disse metoder hjælper med at give sandsynlig indsigt i mekanismerne for kompromitteret BRB-integritet og vurdere effekten af potentielle terapeutiske mål. Nuværende in vivo-billeddannelse eller kvantitative vaskulære lækageassays anvender typisk fluorescerende (natriumfluorescein og dextran), kolorimetrisk (Evans Blue-farvestof og peberrodsperoxidase [HRP] substrat) eller radioaktive sporstoffer14 til påvisning af ekstravasation fra vaskulaturen til omgivende retinale væv med mikroskopbilleddannelse eller i isoleret vævslamsat. Et ideelt sporstof til kvantificering af vaskulær integritet bør være inert og stort nok til frit at gennemtrænge kompromitterede kar, mens det er begrænset i sunde og intakte kapillærer. Metoder, der anvender natriumfluorescein eller fluoresceinisothiocyanatkonjugeret dextran (FITC-dextran) i levende fundus fluorescein-angiografi (FFA) eller isolerede retinale flade monteringer, anvendes i vid udstrækning til kvantificering af retinal ekstravasation in vivo eller ex vivo. FITC-dextran har den fordel, at den er tilgængelig i forskellige molekylvægte fra 4-70 kDa til størrelsesselektive undersøgelser15,16,17. FITC-albumin (~68 kDa) er et alternativt stort proteinsporstof af biologisk relevans for vaskulære lækageundersøgelser18. Evans Blue-farvestof, injiceret intrakardialt19, retro-orbitalt eller gennem halevenen 20, er også afhængig af dets binding med endogent albumin for at danne et stort molekyle, der kan kvantificeres ved for det meste spektrofotometrisk detektion eller, mindre almindeligt, fluorescensmikroskopi i flade monteringer20,21. Disse kvantitative eller lette billeddannelsesmetoder skelner imidlertid ofte ikke paracellulær transport fra trans-endoteltransport. Til specifik analyse af transcytose med ultrastrukturel visualisering af transcytosede vesikler anvendes spormolekyler såsom HRP typisk til at lokalisere transcytosede vesikler i endotelceller, der kan observeres under et elektronmikroskop22,23,24 (figur 3A-C).

Udviklingen og anvendelsen af in vitro iBRB-modeller til evaluering af endotelcellepermeabiliteten kan give en robust vurdering med høj kapacitet som supplement til in vivo-eksperimenter og støtte undersøgelsen af molekylære regulatorer af vaskulær lækage. Almindeligt anvendte assays til vurdering af paracellulær transport og integritet af tætte kryds inkluderer trans-endotel elektrisk modstand (TEER), et mål for ionisk konduktans (figur 4) 2,25 og in vitro vaskulær lækageassay ved hjælp af små molekylvægt fluorescerende sporstoffer 26. Derudover er transferrinbaserede transcytoseassays modellering af BBB blevet brugt til at udforske clathrinafhængig transcytose27. På trods af dette er assays til evaluering af BRB og mere specifikt retinal EC caveolar transcytose in vitro begrænset.

I denne undersøgelse beskriver vi et EC-transcytoseassay ved hjælp af humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMEC’er) som en in vitro-model til bestemmelse af iBRB-permeabilitet og EC-transcytose. Dette assay er baseret på HRMEC’ers evne til at transportere transferrin eller HRP via henholdsvis de receptormedierede eller caveolaeafhængige transcytoseveje (figur 2). HRMEC’er dyrket til fuld konfluens i det apikale kammer (dvs. filterindsats) blev inkuberet med fluorescerende konjugeret transferrin (Cy3-Tf) eller HRP for at måle fluorescensintensiteten svarende til niveauerne af transferrin eller HRP overført til bundkammeret udelukkende gennem EC-transcytose. Sammenløbet af cellemonolaget kan bekræftes ved at måle TEER, hvilket indikerer den stramme krydsintegritet25. For at demonstrere TEER- og transcytoseassay-teknikken blev der anvendt kendte molekylære modulatorer af vaskulær permeabilitet og EC-transcytose, herunder vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF)28 og dem i Wnt-signalering (Wnt-ligander: Wnt3a og Norrin)29.

Protocol

Alle dyreforsøg blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) på Boston Children’s Hospital til generering af lysmikroskopi og EM-billeder (figur 3). Protokoller for in vivo-undersøgelserne kan fås ved henvendelse til Wang et al.24. Alle eksperimenter, der involverede humane retinale mikrovaskulære endotelceller (HRMEC’er), blev godkendt af Institutional Biosafety Committee (IBC) på Boston Children’s Hospital. <p class="jove_t…

Representative Results

EM-billeder af retinal vaskulært endotel viser transcytotisk vesikulær transport og caveolære vesikler i endotelceller in vivo.EC-transcytose kan visualiseres in vivo inden for retinale tværsnit med mørkebrunt bundfald, der afspejler HRP-holdige blodkar under et lysmikroskop (figur 3A) og som elektrontæt bundfald, der indikerer HRP-holdige transcytotiske vesikler (figur 3B, C) ved hjælp af et tra…

Discussion

BRB spiller en væsentlig rolle i retinal sundhed og sygdom. In vitro-teknikker, der vurderer vaskulær permeabilitet, har vist sig at være afgørende værktøjer i undersøgelser vedrørende barriere (BRB / BBB) udvikling og funktion. Den her beskrevne procedure kan anvendes til at studere de molekylære mekanismer, der ligger til grund for EC-transcytose eller evaluere relaterede molekylære modulatorer, der påvirker BRB-permeabiliteten. In vitro EC transcytose assays har flere fordele i forhold til…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud (R01 EY028100, EY024963 og EY031765) til JC. ZW blev støttet af et Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Materials

Biological Safety Cabinet  Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 1286
Cell culture petridish  Nest Biotechnology 704001
Centrifuge  Eppendorf 5702
Centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc. 352097
Centrifuge tubes (50 mL) Denville Scientific Inc. C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin  Jackson ImmunoResearch AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza Bioscience CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements Lonza Bioscience CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) Millipore MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS) Lonza Bioscience CC-4102B
Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Hemocytometer (2-chip) Bulldog Bio DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) Cell Systems ACBRI 181
Incubator Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 3110
L cells (for Control-conditioned medium) ATCC CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) ATCC CRL-2647
Light microscope Leica DMi1
Multimode Plate Reader EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) GIBCO 10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit Thermo Fisher Scientific 15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin) R&D Systems 3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) R&D Systems 293-VE
Syringe filter (0.22 µm) Millipore SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) Corning Inc. CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) GIBCO 25-200-072
Water bath Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) Selleckchem S1180
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  2. Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
  3. Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
  4. Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
  5. Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877 (2021).
  6. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211 (2019).
  7. Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
  8. Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
  9. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  10. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  11. Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
  12. Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
  13. Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , 75-107 (2006).
  14. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
  15. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, 440-446 (1991).
  16. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
  17. Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903 (2021).
  18. Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
  19. Honeycutt, S. E., O’Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  20. Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154 (2020).
  21. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  22. Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
  23. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  24. Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
  25. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  26. Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
  27. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
  28. Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
  29. Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
  30. Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
  31. Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188 (2020).
  32. Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
  33. Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953 (2017).
  34. Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
  35. Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
  36. Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
  37. Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
  38. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
  39. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  40. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  41. Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
  42. Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
  43. Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
  44. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  45. Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
  46. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
  47. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  48. Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019 (2018).
  49. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  50. Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148 (2022).

Tags

Keywords: Endothelial Cell Transcytosis AssayIn Vitro ModelBlood-retinal Barrier PermeabilityVascular BiologyEye ResearchBrain ResearchBlood-brain BarrierTEER MeasurementCell CultureHuman Retinal Microvascular Endothelial CellsHRMECsCell SeedingCell Culture Filter InsertsGelatin Coating
check_url/pt/64076?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F., Maurya, M., Blomfield, A. K., Tomita, Y., Chen, J. Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability. J. Vis. Exp. (184), e64076, doi:10.3791/64076 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image