Summary

فحص نقل الخلايا البطانية كنموذج في المختبر لتقييم نفاذية الحاجز الدموي الشبكي الداخلي

Published: June 07, 2022
doi:

Summary

يوضح هذا البروتوكول مقايسة عبر الخلايا البطانية في المختبر كنموذج لتقييم نفاذية الحاجز الدموي الداخلي للشبكية عن طريق قياس قدرة الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للشبكية البشرية على نقل بيروكسيديز الفجل عبر الخلايا في عمليات النقل عبر الخلايا بوساطة الكهف.

Abstract

يساهم خلل الحاجز الدموي الشبكي (BRB) في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من أمراض العين الوعائية ، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى وذمة شبكية العين وفقدان البصر اللاحق. يتكون الحاجز الدموي الداخلي للشبكية (iBRB) بشكل أساسي من بطانة وعائية شبكية العين ذات نفاذية منخفضة في ظل الظروف الفسيولوجية. يتم تنظيم هذه الميزة من النفاذية المنخفضة بإحكام والحفاظ عليها من خلال معدلات منخفضة من النقل شبه الخلوي بين الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة المجاورة للشبكية ، وكذلك النقل عبر الخلايا (transcytosis) من خلالها. قد يوفر تقييم نفاذية الحاجز عبر الخلوي في الشبكية رؤى أساسية حول سلامة iBRB في الصحة والمرض. في هذه الدراسة ، نصف فحص الخلايا البطانية (EC) ، كنموذج في المختبر لتقييم نفاذية iBRB ، باستخدام الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة للشبكية البشرية (HRMECs). يقيم هذا الفحص قدرة HRMECs على نقل الترانسفيرين وبيروكسيديز الفجل (HRP) في عمليات النقل عبر الخلايا بوساطة المستقبلات والكهف ، على التوالي. تم احتضان مركبات HRMECs المتقاربة بالكامل المستزرعة على غشاء مسامي مع ترانسفيرين موسوم بالفلورسنت (transcytosis المعتمد على clathrin) أو HRP (transcytosis بوساطة الكهف) لقياس مستويات الترانسفيرين أو HRP المنقولة إلى الغرفة السفلية ، مما يدل على مستويات transcytosis عبر الطبقة الأحادية EC. تم تعديل إشارات Wnt ، وهي مسار معروف ينظم iBRB ، لإظهار طريقة فحص transcytosis القائمة على HRP بوساطة الكهف. قد يوفر فحص EC transcytosis الموصوف هنا أداة مفيدة للتحقيق في المنظمين الجزيئيين لنفاذية EC وسلامة iBRB في أمراض الأوعية الدموية ولفحص أنظمة توصيل الأدوية.

Introduction

شبكية العين البشرية هي واحدة من أعلى الأنسجة التي تتطلب الطاقة في الجسم. يتطلب الأداء السليم للشبكية العصبية إمدادات فعالة من الأكسجين والمواد المغذية إلى جانب تدفق مقيد من الجزيئات الأخرى التي يحتمل أن تكون ضارة لحماية بيئة الشبكية ، والتي يتم توسطها عبر حاجز الدم والشبكية (BRB)1. على غرار الحاجز الدموي الدماغي (BBB) في الجهاز العصبي المركزي ، يعمل BRB كحاجز انتقائي في العين ، حيث ينظم حركة الأيونات والماء والأحماض الأمينية والسكر داخل وخارج شبكية العين. يحافظ BRB أيضا على توازن الشبكية وامتيازه المناعي من خلال منع التعرض لعوامل الدورة الدموية مثل الخلايا المناعية والأجسام المضادة ومسببات الأمراض الضارة2. يساهم خلل BRB في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من أمراض العين الوعائية ، مثل اعتلال الشبكية السكري ، والتنكس البقعي المرتبط بالعمر (AMD) ، واعتلال الشبكية الخداجي (ROP) ، وانسداد الوريد الشبكي ، والتهاب القزحية ، مما يؤدي إلى وذمة وعائية المنشأ وفقدان البصر اللاحق3،4،5.

يتكون BRB من حاجزين منفصلين لشبكتين وعائيتين عينيتين متميزتين ، على التوالي: الأوعية الدموية الشبكية و choriocapillaris المعششة تحت شبكية العين. يتكون BRB الداخلي (iBRB) في المقام الأول من الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في الشبكية (RMECs) التي تبطن الأوعية الدموية الدقيقة في الشبكية ، والتي تغذي الطبقات العصبية الداخلية للشبكية. من ناحية أخرى ، تشكل ظهارة صبغة الشبكية المكون الرئيسي ل BRB الخارجي ، والذي يقع بين شبكية العين الحسية العصبية و choriocapillaris2. بالنسبة ل iBRB ، يحدث النقل الجزيئي عبر RMECs من خلال كل من الطرق شبه الخلوية وعبر الخلوية (الشكل 1). تعتمد الدرجة العالية من انتقائية المواد عبر iBRB على (i) وجود مجمعات البروتين الموصلة التي تقيد النقل شبه الخلوي بين الخلايا البطانية المجاورة (ECs) ، و (ii) مستويات التعبير المنخفضة لوسطاء الكهف والناقلات والمستقبلات داخل الخلايا البطانية التي تحافظ على معدلات منخفضة من النقل عبر الخلايا1،6،7،8 . تتكون مجمعات الوصلات التي تنظم التدفق شبه الخلوي من تقاطعات ضيقة (كلودين ، أوكلودين) ، تلتصق بالتقاطعات (كادهيرين VE) ، وتقاطعات الفجوة (connexins) ، مما يسمح بمرور الماء والمركبات الصغيرة القابلة للذوبان في الماء. في حين تنتشر الجزيئات الصغيرة المحبة للدهون بشكل سلبي عبر المناطق الداخلية من RMECs ، يتم تنظيم حركة الجزيئات الأكبر محبة للدهون والمحبة للماء من خلال مسارات عبر البطانية مدفوعة ب ATP بما في ذلك النقل الحويصلي وناقلات الغشاء 5,9.

يمكن تصنيف الترانسسيتوسيس الحويصلي على أنه ترانسكيتوسيس كهفي بوساطة الكافولين، وترانسكتوري كنزية كليبرات العين المعتمد على الكلاثرين (وبوساطة المستقبلات)، وندرة الخلايا الكبيرة المستقلة عن الكلاثرين (الشكل 2). تتضمن عمليات النقل الحويصلي هذه حويصلات مختلفة الحجم ، حيث تكون الماكروبينوسومات هي الأكبر (تتراوح من 200-500 نانومتر) وتكون الكهف هي الأصغر (بمتوسط 50-100 نانومتر) ، في حين تتراوح الحويصلات المغلفة بالكلاثرين من 70-150 نانومتر10. Caveolae هي غزوات غشاء بلازما غنية بالدهون على شكل قارورة مع معطف بروتين ، يتكون في المقام الأول من caveolin-1 الذي يربط الكوليسترول الغشائي الدهني والبروتينات الهيكلية والإشارات الأخرى عبر مجال سقالات الكهف11. تعمل الكافيولين جنبا إلى جنب مع الكافين المتصل محيطيا لتعزيز استقرار الكهف في غشاء البلازما12. قد تحمل الأغشية الكهفية أيضا مستقبلات لجزيئات أخرى مثل الأنسولين والألبومين والبروتينات الدهنية المتداولة بما في ذلك البروتين الدهني عالي الكثافة (HDL) والبروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL) للمساعدة في حركتها عبر الخلايا البطانية13. أثناء التطوير ، يعتمد تكوين BRB الوظيفي على قمع EC transcytosis8. وبالتالي ، فإن بطانة الشبكية الناضجة تحتوي على مستويات منخفضة نسبيا من مستقبلات الكافولا والكافولين-1 والألبومين فيما يتعلق بالخلايا البطانية الأخرى في ظل الظروف الفسيولوجية ، مما يساهم في خصائصها الحاجزة 4,9.

نظرا لأن انهيار iBRB هو السمة المميزة الرئيسية للعديد من حالات العين المرضية ، فمن الضروري تطوير طرق لتقييم نفاذية الأوعية الدموية في شبكية العين في الجسم الحي وفي المختبر. تساعد هذه الأساليب على توفير رؤى محتملة حول آليات سلامة BRB المعرضة للخطر وتقييم فعالية الأهداف العلاجية المحتملة. عادة ما تستخدم فحوصات التصوير الحالية في الجسم الحي أو فحوصات تسرب الأوعية الدموية الكمية الفلورسنت (فلوريسين الصوديوم والدكستان) ، أو قياس الألوان (صبغة إيفانز الزرقاء وركيزة بيروكسيديز الفجل [HRP]) ، أو المقتفيات الإشعاعية14 للكشف عن الإسراف من الأوعية الدموية إلى أنسجة الشبكية المحيطة باستخدام التصوير المجهري أو في محللات الأنسجة المعزولة. يجب أن يكون المقتفي المثالي لقياس سلامة الأوعية الدموية خاملا وكبيرا بما يكفي لتخلل الأوعية المعرضة للخطر بحرية أثناء حبسه داخل الشعيرات الدموية السليمة والسليمة. تستخدم الطرق التي تستخدم فلوريسين الصوديوم أو الفلوريسين إيزوثيوسيانات ديكستران المقترن (FITC-dextran) في تصوير الأوعية الدموية الحية للقاع (FFA) أو حوامل الشبكية المسطحة المعزولة على نطاق واسع لقياس إسراف الشبكية في الجسم الحي أو الجسم الحي السابق. يتميز FITC-dextran بأنه متاح في أوزان جزيئية مختلفة تتراوح من 4-70 kDa للدراسات الانتقائية للحجم15،16،17. FITC-albumin (~ 68 kDa) هو متتبع بروتين بديل كبير الحجم ذو صلة بيولوجية بدراسات تسرب الأوعية الدموية18. تعتمد صبغة إيفانز بلو ، التي يتم حقنها داخل القلب19 ، أو في المدار الرجعي ، أو من خلال الوريد الذيل 20 ، أيضا على ارتباطها بالألبومين الداخلي المنشأ لتشكيل جزيء كبير يمكن تحديده كميا عن طريق الكشف عن الطيف الضوئي في الغالب أو ، بشكل أقل شيوعا ، المجهر الفلوري في حوامل مسطحة20،21. ومع ذلك، فإن منهجيات التصوير الكمي أو الضوئي هذه غالبا ما لا تميز النقل شبه الخلوي عن النقل عبر البطانة. بالنسبة للتحليل المحدد لانتقال الخلايا مع التصور فوق الهيكلي للحويصلات المتحولة عبر الخلايا ، تستخدم جزيئات التتبع مثل HRP عادة لتحديد موقع الحويصلات المتحولة داخل الخلايا البطانية التي يمكن ملاحظتها تحت المجهر الإلكتروني 22،23،24 (الشكل 3A-C).

يمكن أن يوفر تطوير واستخدام نماذج iBRB في المختبر لتقييم نفاذية الخلايا البطانية تقييما قويا وعالي الإنتاجية لاستكمال التجارب في الجسم الحي والمساعدة في التحقيق في المنظمين الجزيئيين لتسرب الأوعية الدموية. تشمل المقايسات الشائعة الاستخدام لتقييم النقل شبه الخلوي وسلامة التقاطعات الضيقة المقاومة الكهربائية عبر البطانية (TEER) ، وهو مقياس للتوصيل الأيوني (الشكل 4) 2,25 ، واختبار تسرب الأوعية الدموية في المختبر باستخدام مقتفيات الفلورسنت الصغيرة ذات الوزن الجزيئي26. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام اختبارات transcytosis القائمة على الترانسفيرين نمذجة BBB لاستكشاف transcytosis المعتمد على clathrin27. على الرغم من ذلك ، فإن الفحوصات لتقييم BRB ، وبشكل أكثر تحديدا ، transcytosis الكهفية EC شبكية العين في المختبر محدودة.

في هذه الدراسة ، نصف فحص EC transcytosis باستخدام الخلايا البطانية الوعائية الدقيقة في شبكية العين البشرية (HRMECs) كنموذج في المختبر لتحديد نفاذية iBRB و EC transcytosis. يعتمد هذا الفحص على قدرة HRMECs على نقل الترانسفيرين أو HRP عبر مسارات transcytosis التي تتوسط فيها المستقبلات أو المعتمدة على الكهف ، على التوالي (الشكل 2). تم احتضان HRMECs المستزرعة إلى الالتقاء الكامل في الغرفة القمية (أي إدراج المرشح) مع الترانسفيرين المترافق مع الفلورسنت (Cy3-Tf) أو HRP لقياس شدة التألق المقابلة لمستويات الترانسفيرين أو HRP المنقولة إلى الغرفة السفلية من خلال EC transcytosis فقط. يمكن تأكيد التقاء الطبقة الأحادية للخلية عن طريق قياس TEER ، مما يشير إلى سلامة التقاطع الضيق25. لإثبات تقنية اختبار TEER و transcytosis ، تم استخدام المعدلات الجزيئية المعروفة لنفاذية الأوعية الدموية و transcytosis EC ، بما في ذلك عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF)28 وتلك الموجودة في إشارات Wnt (روابط Wnt: Wnt3a و Norrin)29.

Protocol

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC) في مستشفى بوسطن للأطفال لتوليد المجهر الضوئي وصور EM (الشكل 3). يمكن الحصول على بروتوكولات للدراسات في الجسم الحي من Wang et al.24. تمت الموافقة على جميع التجارب ال?…

Representative Results

تظهر صور EM للبطانة الوعائية الشبكية النقل الحويصلي عبر الخلوي والحويصلات الكهفية في الخلايا البطانية في الجسم الحي.يمكن تصور ترانسسيتوسيس EC في الجسم الحي داخل المقاطع العرضية للشبكية مع راسب بني داكن يعكس الأوعية الدموية المحتوية على HRP تحت المجهر…

Discussion

يلعب BRB دورا أساسيا في صحة الشبكية ومرضها. أثبتت التقنيات المخبرية التي تقيم نفاذية الأوعية الدموية أنها أدوات حاسمة في الدراسات المتعلقة بتطوير الحاجز (BRB / BBB) ووظيفته. يمكن استخدام الإجراء الموصوف هنا لدراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء ترانسسيتوزيس EC أو تقييم المعدلات الجزيئية ذ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (R01 EY028100 و EY024963 و EY031765) إلى JC. تم دعم ZW من قبل مؤسسة Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Materials

Biological Safety Cabinet  Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 1286
Cell culture petridish  Nest Biotechnology 704001
Centrifuge  Eppendorf 5702
Centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc. 352097
Centrifuge tubes (50 mL) Denville Scientific Inc. C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin  Jackson ImmunoResearch AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza Bioscience CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements Lonza Bioscience CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) Millipore MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS) Lonza Bioscience CC-4102B
Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Hemocytometer (2-chip) Bulldog Bio DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) Cell Systems ACBRI 181
Incubator Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 3110
L cells (for Control-conditioned medium) ATCC CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) ATCC CRL-2647
Light microscope Leica DMi1
Multimode Plate Reader EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) GIBCO 10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit Thermo Fisher Scientific 15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin) R&D Systems 3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) R&D Systems 293-VE
Syringe filter (0.22 µm) Millipore SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) Corning Inc. CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) GIBCO 25-200-072
Water bath Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) Selleckchem S1180

Referências

  1. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  2. Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
  3. Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
  4. Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
  5. Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877 (2021).
  6. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211 (2019).
  7. Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
  8. Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
  9. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  10. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  11. Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
  12. Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
  13. Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , 75-107 (2006).
  14. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
  15. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, 440-446 (1991).
  16. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
  17. Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903 (2021).
  18. Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
  19. Honeycutt, S. E., O’Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  20. Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154 (2020).
  21. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  22. Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
  23. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  24. Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
  25. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  26. Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
  27. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
  28. Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
  29. Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
  30. Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
  31. Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188 (2020).
  32. Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
  33. Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953 (2017).
  34. Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
  35. Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
  36. Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
  37. Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
  38. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
  39. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  40. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  41. Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
  42. Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
  43. Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
  44. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  45. Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
  46. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
  47. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  48. Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019 (2018).
  49. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  50. Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148 (2022).
check_url/pt/64076?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F., Maurya, M., Blomfield, A. K., Tomita, Y., Chen, J. Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability. J. Vis. Exp. (184), e64076, doi:10.3791/64076 (2022).

View Video