Ensaio de Transcitose de Células Endoteliais como Modelo In Vitro para Avaliar a Permeabilidade da Barreira Interna Sangue-Retina

Summary

Este protocolo ilustra um ensaio de transcitose de células endoteliais in vitro como um modelo para avaliar a permeabilidade da barreira sangue-retina interna, medindo a capacidade das células endoteliais microvasculares da retina humana de transportar peroxidase de rábano através das células em processos de transporte transcelular mediados por cavéolas.

Abstract

A disfunção da barreira sangue-retina (BRB) contribui para a fisiopatologia de várias doenças oculares vasculares, muitas vezes resultando em edema da retina e subsequente perda de visão. A barreira hemato-retiniana interna (iBRB) é composta principalmente de endotélio vascular da retina com baixa permeabilidade em condições fisiológicas. Esta característica de baixa permeabilidade é rigidamente regulada e mantida por baixas taxas de transporte paracelular entre as células endoteliais microvasculares adjacentes da retina, bem como o transporte transcelular (transcitose) através delas. A avaliação da permeabilidade da barreira transcelular da retina pode fornecer insights fundamentais sobre a integridade do iBRB na saúde e na doença. Neste estudo, descrevemos um ensaio de transcitose de células endoteliais (CE), como um modelo in vitro para avaliar a permeabilidade do iBRB, utilizando células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs). Este ensaio avalia a capacidade dos HRMECs de transportar transferrina e peroxidase de rábano (HRP) em processos de transporte transcelular mediados por receptores e cavéolas, respectivamente. HRMECs totalmente confluentes cultivados em membrana porosa foram incubados com transferrina marcada com fluorescência (transcitose dependente de clatrina) ou HRP (transcitose mediada por cavéolas) para medir os níveis de transferrina ou HRP transferidos para a câmara inferior, indicativos de níveis de transcitose em toda a monocamada da CE. A sinalização Wnt, uma via conhecida que regula o iBRB, foi modulada para demonstrar o método de ensaio de transcitose baseado em HRP mediado por cavéolas. O ensaio de transcitose EC descrito aqui pode fornecer uma ferramenta útil para investigar os reguladores moleculares da permeabilidade CE e da integridade do iBRB em patologias vasculares e para o rastreamento de sistemas de liberação de medicamentos.

Introduction

A retina humana é um dos tecidos que mais demandam energia no corpo. O bom funcionamento da retina neural requer um suprimento eficiente de oxigênio e nutrientes, juntamente com um fluxo restrito de outras moléculas potencialmente nocivas para proteger o ambiente da retina, que é mediado pela barreira sangue-retina (BRB)¹. Semelhante à barreira hematoencefálica (BBB) no sistema nervoso central, o BRB atua como uma barreira seletiva no olho, regulando o movimento de íons, água, aminoácidos e açúcar dentro e fora da retina. O BRB também mantém a homeostase da retina e seu privilégio imunológico, impedindo a exposição a fatores circulatórios, como células imunes, anticorpos e patógenos nocivos². A disfunção do BRB contribui para a fisiopatologia de diversas doenças oculares vasculares, como retinopatia diabética, degeneração macular relacionada à idade (DMRI), retinopatia da prematuridade (ROP), oclusão da veia retiniana e uveíte, resultando em edema vasogênico e subsequente perda de visão ^3,4,5.

O BRB consiste em duas barreiras separadas para duas redes vasculares oculares distintas, respectivamente: a vasculatura da retina e o coriocapilar fenestrado abaixo da retina. O BRB interno (iBRB) é composto principalmente de células endoteliais microvasculares da retina (RMECs) que revestem a microvasculatura da retina, que nutre as camadas neuronais internas da retina. Por outro lado, o epitélio pigmentar da retina forma o principal componente do BRB externo, que se encontra entre a retina neurossensorial e o coriocapilar². Para o iBRB, o transporte molecular através das RMECs ocorre por via paracelular e transcelular (Figura 1). O alto grau de seletividade de substâncias em todo o iBRB depende (i) da presença de complexos proteicos juncionais que restringem o transporte paracelular entre células endoteliais (CE) adjacentes e (ii) baixos níveis de expressão de mediadores, transportadores e receptores de cavéolas dentro das células endoteliais que mantêm baixas taxas de transporte transcelular 1,6,7,8 . Os complexos juncionais que regulam o fluxo paracelular são compostos por junções apertadas (claudinas, occludinas), junções aderentes (caderinas VE) e junções gap (conexinas), permitindo a passagem de água e pequenos compostos solúveis em água. Enquanto pequenas moléculas lipofílicas se difundem passivamente pelo interior das RMECs, o movimento de moléculas lipofílicas e hidrofílicas maiores é regulado por vias transendoteliais impulsionadas por ATP, incluindo transporte vesicular e transportadores de membrana ^5,9.

A transcitose vesicular pode ser categorizada em transcitose caveolar mediada por caveolina, transcitose dependente de clatrina (e mediada por receptor) e macropinocitose independente de clatrina (Figura 2). Esses processos de transporte vesicular envolvem vesículas de tamanhos diferentes, com macropinossomos sendo os maiores (variando de 200-500 nm) e cavéolas sendo os menores (com média de 50-100 nm), enquanto as vesículas revestidas de clatrina variam de 70-150 nm¹⁰. As cavéolas são invaginações de membrana plasmática ricas em lipídios em forma de frasco com revestimento proteico, composto principalmente de caveolina-1 que se liga ao colesterol da membrana lipídica e a outras proteínas estruturais e sinalizadoras através de seu domínio cavamolíne-andaime¹¹. As caveolinas trabalham em conjunto com a cavina periféricamente ligada para promover a estabilização das cavéolas na membrana plasmática¹². As membranas caveolares também podem transportar receptores para outras moléculas, como insulina, albumina e lipoproteínas circulantes, incluindo lipoproteína de alta densidade (HDL) e lipoproteína de baixa densidade (LDL), para auxiliar seu movimento através das células endoteliais¹³. Durante o desenvolvimento, a formação de BRB funcional depende da supressão da transcitose CE⁸. O endotélio retiniano maduro, portanto, apresenta níveis relativamente baixos de receptores de cavéolas, casofalina-1 e albumina em relação a outras células endoteliais em condições fisiológicas, contribuindo para suas propriedades de barreira ^4,9.

Como a degradação do iBRB é uma das principais características de muitas condições oculares patológicas, é essencial desenvolver métodos para avaliar a permeabilidade vascular da retina in vivo e in vitro. Esses métodos ajudam a fornecer insights prováveis sobre os mecanismos de integridade comprometida do BRB e a avaliar a eficácia de potenciais alvos terapêuticos. Exames de imagem in vivo atuais ou ensaios quantitativos de vazamento vascular geralmente empregam fluorescentes (fluoresceína de sódio e dextrano), colorimétricos (corante Evans Blue e substrato de peroxidase de rábano [HRP]) ou marcadores radioativos¹⁴ para detectar extravasamento da vasculatura para tecidos retinianos circundantes com imagens de microscópio ou em lisado de tecido isolado. Um marcador ideal para quantificar a integridade vascular deve ser inerte e grande o suficiente para permear livremente os vasos comprometidos enquanto confinados em capilares saudáveis e intactos. Métodos que empregam fluoresceína de sódio ou dextrano conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC-dextrano) em angiografia de fluoresceína de fundo de olho vivo (FFA) ou montagens planas isoladas da retina são amplamente utilizados para quantificar o extravasamento da retina in vivo ou ex vivo. O FITC-dextran tem a vantagem de estar disponível em diferentes pesos moleculares variando de 4-70 kDa para estudos seletivos de tamanho^15,16,17. A albumina FITC (~68 kDa) é um traçador alternativo de proteínas de grande porte de relevância biológica para estudos de extravasamento vascular¹⁸. O corante Evans Blue, injetado intracardialmente¹⁹, retro-orbitalmente ou através da veia caudal 20, também depende de sua ligação com albumina endógena para formar uma molécula grande que pode ser quantificada principalmente por detecção espectrofotométrica ou, menos comumente, microscopia de fluorescência em montagens planas^20,21. Essas metodologias de imagem quantitativa ou leve, no entanto, muitas vezes não distinguem o transporte paracelular do transporte transendotelial. Para a análise específica da transcitose com visualização ultraestrutural de vesículas transcitosadas, moléculas traçadoras, como a HRP, são tipicamente utilizadas para localizar vesículas transcitosadas dentro de células endoteliais que podem ser observadas em microscópio eletrônico ^22,23,24 (Figura 3A-C).

O desenvolvimento e o uso de modelos de iBRB in vitro para avaliar a permeabilidade das células endoteliais poderiam fornecer uma avaliação robusta e de alto rendimento para complementar os experimentos in vivo e auxiliar na investigação de reguladores moleculares de vazamento vascular. Ensaios comumente utilizados para avaliar o transporte paracelular e a integridade de junções apertadas incluem resistência elétrica transendotelial (TEER), uma medida de condutância iônica (Figura 4)^2,25 e ensaio de vazamento vascular in vitro usando marcadores fluorescentes de pequeno peso molecular²⁶. Além disso, ensaios de transcitose à base de transferrina modelando BBB têm sido utilizados para explorar a transcitose dependente de clatrina²⁷. Apesar disso, os ensaios para avaliar o BRB e, mais especificamente, a transcitose caveolar da CE retiniana in vitro são limitados.

Neste estudo, descrevemos um ensaio de transcitose CE usando células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs) como modelo in vitro para determinar a permeabilidade do iBRB e a transcitose CE. Este ensaio baseia-se na capacidade dos HRMECs de transportar transferrina ou HRP através das vias de transcitose mediadas por receptores ou dependentes de cavéolas, respectivamente (Figura 2). Os HRMECs cultivados até a confluência total na câmara apical (ou seja, inserção de filtro) foram incubados com transferrina conjugada fluorescente (Cy3-Tf) ou HRP para medir a intensidade de fluorescência correspondente aos níveis de transferrina ou HRP transferidos para a câmara inferior apenas através da transcitose CE. A confluência da monocamada celular pode ser confirmada pela medição do TEER, indicando a integridade da junção apertada²⁵. Para demonstrar a técnica de TEER e ensaio de transcitose, foram utilizados moduladores moleculares conhecidos de permeabilidade vascular e transcitose CE, incluindo o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF)²⁸ e aqueles na sinalização Wnt (ligantes Wnt: Wnt3a e Norrin)²⁹.

Protocol

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Boston Children’s Hospital para a geração de microscopia de luz e imagens EM (Figura 3). Os protocolos para os estudos in vivo podem ser obtidos de Wang et al.24. Todos os experimentos envolvendo células endoteliais microvasculares da retina humana (HRMECs) foram aprovados pelo Comitê Institucional de Biossegurança (IBC) do Boston Children’s Hosp…

Representative Results

Imagens EM de endotélio vascular da retina mostram transporte vesicular transcitótico e vesículas caveolares em células endoteliais in vivo.A transcitose EC pode ser visualizada in vivo dentro de cortes transversais da retina com precipitado marrom escuro refletindo vasos sanguíneos contendo HRP sob um microscópio de luz (Figura 3A) e como precipitado denso em elétrons indicativo de vesículas transcitóticas contendo HRP (<strong class="xfig…

Discussion

O BRB desempenha um papel essencial na saúde e na doença da retina. Técnicas in vitro que avaliam a permeabilidade vascular têm se mostrado ferramentas cruciais em estudos sobre o desenvolvimento e a função da barreira (BRB/BBB). O procedimento aqui descrito poderia ser utilizado para estudar os mecanismos moleculares subjacentes à transcitose CE ou avaliar moduladores moleculares relacionados que afetam a permeabilidade do BRB. In vitro Os ensaios de transcitose EC têm múltiplas vantagens em r…

Materials

Biological Safety Cabinet	Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific	1286
Cell culture petridish	Nest Biotechnology	704001
Centrifuge	Eppendorf	5702
Centrifuge tubes (15 mL)	Corning Inc.	352097
Centrifuge tubes (50 mL)	Denville Scientific Inc.	C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin	Jackson ImmunoResearch	AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2)	Lonza Bioscience	CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements	Lonza Bioscience	CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)	Millipore	MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS)	Lonza Bioscience	CC-4102B
Gelatin	Sigma-Aldrich	G7765
Hemocytometer (2-chip)	Bulldog Bio	DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP)	Sigma-Aldrich	P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC)	Cell Systems	ACBRI 181
Incubator	Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific	3110
L cells (for Control-conditioned medium)	ATCC	CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium)	ATCC	CRL-2647
Light microscope	Leica	DMi1
Multimode Plate Reader	EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x)	GIBCO	10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit	Thermo Fisher Scientific	15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin)	R&D Systems	3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF)	R&D Systems	293-VE
Syringe filter (0.22 µm)	Millipore	SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert)	Corning Inc.	CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x)	GIBCO	25-200-072
Water bath	Precision, Thermo Fisher Scientific	51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor)	Selleckchem	S1180