Анализ трансцитоза эндотелиальных клеток как модель in vitro для оценки проницаемости внутреннего барьера крови и сетчатки
Summary
Этот протокол иллюстрирует анализ трансцитоза эндотелиальных клеток in vitro в качестве модели для оценки проницаемости внутреннего барьера крови и сетчатки путем измерения способности микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки человека транспортировать пероксидазу хрена через клетки в трансклеточных процессах трансклеточного транспорта, опосредованных кавеолами.
Abstract
Дисфункция гемато-сетчаточного барьера (БРБ) способствует патофизиологии ряда сосудистых заболеваний глаз, нередко приводящих к отеку сетчатки и последующей потере зрения. Внутренний гемато-ретинальный барьер (iBRB) в основном состоит из эндотелия сосудов сетчатки с низкой проницаемостью в физиологических условиях. Эта особенность низкой проницаемости жестко регулируется и поддерживается низкими темпами параклеточного транспорта между соседними микрососудистыми эндотелиальными клетками сетчатки, а также трансклеточным транспортом (трансцитозом) через них. Оценка проницаемости трансклеточного барьера сетчатки может дать фундаментальное представление о целостности iBRB в здоровье и болезни. В этом исследовании мы описываем анализ трансцитоза эндотелиальных клеток (EC) в качестве модели in vitro для оценки проницаемости iBRB с использованием микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки человека (HRMECs). Этот анализ оценивает способность HRMECs транспортировать трансферрин и пероксидазу хрена (HRP) в рецептор- и кавеолах-опосредованных трансклеточных транспортных процессах соответственно. Полностью сливающиеся HRMECs, культивируемые на пористой мембране, инкубировали с флуоресцентно-меченым трансферрином (клатринозависимый трансцитоз) или HRP (кавеол-опосредованный трансцитоз) для измерения уровней трансферрина или HRP, перенесенных в нижнюю камеру, что свидетельствует об уровнях трансцитоза в монослое ЕС. Передача сигналов Wnt, известный путь, регулирующий iBRB, модулировали для демонстрации метода анализа трансцитоза на основе HRP, опосредованного кавеолами. Анализ трансцитоза EC, описанный здесь, может обеспечить полезный инструмент для исследования молекулярных регуляторов проницаемости EC и целостности iBRB при сосудистых патологиях и для скрининга систем доставки лекарств.
Introduction
Человеческая сетчатка является одной из самых энергоемких тканей в организме. Правильное функционирование нервной сетчатки требует эффективного снабжения кислородом и питательными веществами наряду с ограниченным потоком других потенциально вредных молекул для защиты среды сетчатки, которая опосредована через гемато-ретинальный барьер (BRB)1. Подобно гематоэнцефалическому барьеру (ГЭБ) в центральной нервной системе, БРБ действует как селективный барьер в глазу, регулируя движение ионов, воды, аминокислот и сахара в сетчатке и из нее. BRB также поддерживает гомеостаз сетчатки и его иммунную привилегию, предотвращая воздействие факторов кровообращения, таких как иммунные клетки, антитела и вредные патогены2. Дисфункция BRB способствует патофизиологии некоторых сосудистых заболеваний глаз, таких как диабетическая ретинопатия, возрастная макулярная дегенерация (ВМД), ретинопатия недоношенных (РН), окклюзия вен сетчатки и увеит, что приводит к вазогенному отеку и последующей потере зрения 3,4,5.
BRB состоит из двух отдельных барьеров для двух различных глазных сосудистых сетей, соответственно: сосудистой сетчатки и фенестрированного хориокапилляриса под сетчаткой. Внутренний BRB (iBRB) в основном состоит из микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки (RMECs), выстилающих микроциркулятор сетчатки, который питает внутренние нейронные слои сетчатки. С другой стороны, пигментный эпителий сетчатки образует основной компонент наружного BRB, который находится между нейросенсорной сетчаткой и хориокапиллярием2. Для iBRB молекулярный транспорт через RMECs происходит как по параклеточным, так и по трансклеточным путям (рисунок 1). Высокая степень селективности вещества в iBRB зависит от (i) наличия соединительных белковых комплексов, которые ограничивают параклеточный транспорт между соседними эндотелиальными клетками (EC), и (ii) низких уровней экспрессии медиаторов, транспортеров и рецепторов caveolae в эндотелиальных клетках, которые поддерживают низкие скорости трансклеточного транспорта 1,6,7,8 . Соединительные комплексы, регулирующие параклеточный поток, состоят из плотных соединений (клаудины, окклюдины), адгезивных соединений (VE cadherins) и щелевых соединений (коннексины), что позволяет проходить воде и мелким водорастворимым соединениям. В то время как небольшие липофильные молекулы пассивно диффундируют через внутреннюю часть RMECs, движение более крупных липофильных и гидрофильных молекул регулируется АТФ-управляемыми трансэндотелиальными путями, включая везикулярный транспорт и мембранные транспортеры 5,9.
Везикулярный трансцитоз может быть классифицирован как кавеолин-опосредованный кавеолярный трансцитоз, клатринозависимый (и рецептор-опосредованный) трансцитоз и клатрино-независимый макропиноцитоз (рисунок 2). Эти везикулярные транспортные процессы включают везикулы разного размера, причем макропиносомы являются самыми большими (в диапазоне от 200-500 нм), а кавеолы – самыми маленькими (в среднем 50-100 нм), в то время как везикулы, покрытые клатрином, варьируются от 70-150 нм10. Кавеолы представляют собой колбовидные липидные инвагинации плазматической мембраны с белковой оболочкой, в основном состоящей из кавеолина-1, который связывает холестерин липидной мембраны и другие структурные и сигнальные белки через их кавеолин-каркасный домен11. Кавеолины работают вместе с периферически прикрепленным кавином, способствуя стабилизации кавеол на плазматической мембране12. Кавеолярные мембраны также могут нести рецепторы для других молекул, таких как инсулин, альбумин и циркулирующие липопротеины, включая липопротеины высокой плотности (ЛПВП) и липопротеины низкой плотности (ЛПНП), чтобы помочь их движению через эндотелиальные клетки13. В процессе развития формирование функционального БРБ зависит от подавления ЭК трансцитоза8. Зрелый эндотелий сетчатки, следовательно, имеет относительно низкие уровни кавеол, кавеолин-1 и альбуминовых рецепторов по отношению к другим эндотелиальным клеткам в физиологических условиях, что способствует его барьерным свойствам 4,9.
Поскольку разрушение iBRB является основным признаком многих патологических заболеваний глаз, важно разработать методы оценки проницаемости сосудов сетчатки in vivo и in vitro. Эти методы помогают обеспечить вероятное понимание механизмов нарушения целостности BRB и оценить эффективность потенциальных терапевтических мишеней. Текущая визуализация in vivo или количественные анализы сосудистой утечки обычно используют флуоресцентные (флуоресцеин натрия и декстран), колориметрические (краситель Evans Blue и субстрат пероксидазы хрена [HRP]) или радиоактивные индикаторы14 для обнаружения экстравазации из сосудистой системы в окружающие ткани сетчатки с помощью микроскопической визуализации или в изолированном тканевом лизате. Идеальный индикатор для количественной оценки сосудистой целостности должен быть инертным и достаточно большим, чтобы свободно проникать в скомпрометированные сосуды, находясь в пределах здоровых и неповрежденных капилляров. Методы, использующие флуоресцеин натрия или флуоресцеин изотиоцианат-конъюгированный декстран (FITC-декстран) в флуоресцеиновой ангиографии живого глазного дна (FFA) или изолированных плоских креплениях сетчатки, широко используются для количественной экстравазации сетчатки in vivo или ex vivo. FITC-декстран имеет то преимущество, что он доступен в различных молекулярных массах в диапазоне от 4 до 70 кДа для исследований с выбором размера 15,16,17. FITC-альбумин (~68 кДа) является альтернативным крупногабаритным белковым индикатором, имеющим биологическое значение для исследований сосудистой утечки18. Краситель Evans Blue, вводимый внутрисердечно19, ретроорбитально или через хвостовую вену20, также полагается на его связывание с эндогенным альбумином с образованием большой молекулы, которая может быть количественно определена в основном спектрофотометрическим обнаружением или, реже, флуоресцентной микроскопией в плоских маунтах20,21. Однако эти количественные или световые методологии визуализации часто не отличают параклеточный транспорт от трансэндотелиального транспорта. Для специфического анализа трансцитоза с ультраструктурной визуализацией трансцитозированных везикул индикаторные молекулы, такие как HRP, обычно используются для определения местоположения трансцитозированных везикул в эндотелиальных клетках, которые можно наблюдать под электронным микроскопом 22,23,24 (рисунок 3A-C).
Разработка и использование моделей in vitro iBRB для оценки проницаемости эндотелиальных клеток может обеспечить надежную и высокую оценку пропускной способности, чтобы дополнить эксперименты in vivo и помочь в исследовании молекулярных регуляторов сосудистой утечки. Обычно используемые анализы для оценки параклеточного транспорта и целостности плотных соединений включают трансэндотелиальное электрическое сопротивление (TEER), меру ионной проводимости (Фиг.4)2,25, и анализ сосудистой утечки in vitro с использованием флуоресцентных индикаторов26 с малой молекулярной массой. Кроме того, анализы трансцитоза на основе трансферрина, моделирующие ГЭБ, были использованы для изучения клатрино-зависимого трансцитоза27. Несмотря на это, анализы для оценки BRB и, более конкретно, кавеолярного трансцитоза EC сетчатки in vitro ограничены.
В этом исследовании мы описываем анализ трансцитоза EC с использованием микрососудистых эндотелиальных клеток сетчатки человека (HRMECs) в качестве модели in vitro для определения проницаемости iBRB и трансцитоза EC. Этот анализ опирается на способность HRMECs транспортировать трансферрин или HRP через рецептор-опосредованные или кавеолы-зависимые пути трансцитоза, соответственно (рисунок 2). HRMECs, культивируемые до полного слияния в апикальной камере (т.е. фильтрующей вставке), инкубировали с флуоресцентно-конъюгированным трансферрином (Cy3-Tf) или HRP для измерения интенсивности флуоресценции, соответствующей уровням трансферрина или HRP, перенесенных в нижнюю камеру исключительно посредством трансцитоза EC. Слияние монослоя ячейки может быть подтверждено измерением TEER, указывающим на целостность плотного соединения25. Для демонстрации метода анализа TEER и трансцитоза использовались известные молекулярные модуляторы проницаемости сосудов и трансцитоза EC, включая фактор роста эндотелия сосудов (VEGF)28 и те, которые находятся в передаче сигналов Wnt (лиганды Wnt: Wnt3a и Norrin)29.
Protocol
Representative Results
Discussion
BRB играет важную роль в здоровье и заболеваниях сетчатки. Методы in vitro , оценивающие проницаемость сосудов, оказались важнейшими инструментами в исследованиях, касающихся развития и функции барьеров (BRB / BBB). Процедура, описанная здесь, может быть использована для изучения молекуляр…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами NIH (R01 EY028100, EY024963 и EY031765) для JC. ZW был поддержан грантом Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.
Materials
| Biological Safety Cabinet | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 1286 | |
| Cell culture petridish | Nest Biotechnology | 704001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Centrifuge tubes (15 mL) | Corning Inc. | 352097 | |
| Centrifuge tubes (50 mL) | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| Cyanine 3-human Transferrin | Jackson ImmunoResearch | AB_2337082 | |
| Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza Bioscience | CC-3156 | |
| Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements | Lonza Bioscience | CC-4176 | |
| EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) | Millipore | MERS00002 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Lonza Bioscience | CC-4102B | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G7765 | |
| Hemocytometer (2-chip) | Bulldog Bio | DHC-N002 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Sigma-Aldrich | P8250 | |
| Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) | Cell Systems | ACBRI 181 | |
| Incubator | Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific | 3110 | |
| L cells (for Control-conditioned medium) | ATCC | CRL-2648 | |
| L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) | ATCC | CRL-2647 | |
| Light microscope | Leica | DMi1 | |
| Multimode Plate Reader | EnSight, PerkinElmer | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) | GIBCO | 10010-023 | |
| QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit | Thermo Fisher Scientific | 15169 | |
| Recombinant human Norrin (rhNorrin) | R&D Systems | 3014-NR | |
| Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) | R&D Systems | 293-VE | |
| Syringe filter (0.22 µm) | Millipore | SLGP033RS | |
| Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) | Corning Inc. | CLS3470-48EA | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) | GIBCO | 25-200-072 | |
| Water bath | Precision, Thermo Fisher Scientific | 51221060 | |
| XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) | Selleckchem | S1180 |
Referências
- Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
- Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
- Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
- Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
- Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877 (2021).
- Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211 (2019).
- Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
- Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
- Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
- De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
- Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
- Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
- Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , 75-107 (2006).
- Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
- Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, 440-446 (1991).
- Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
- Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903 (2021).
- Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
- Honeycutt, S. E., O’Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
- Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154 (2020).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
- Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
- Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
- Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
- Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
- Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
- Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
- Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
- Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188 (2020).
- Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
- Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953 (2017).
- Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
- Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
- Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
- Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
- Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
- Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
- Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
- Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
- Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
- Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
- Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
- Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
- Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
- Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
- Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019 (2018).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148 (2022).
