JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicina

Endotelcellstranscytosanalys som en in vitro-modell för att utvärdera inre blod-retinal barriärpermeabilitet

Published: June 07, 2022
doi:
10.3791/64076
, , , , , ,
1Department of Ophthalmology, Boston Children’s Hospital,Harvard Medical School

Summary

Detta protokoll illustrerar en in vitro-endotelcellstranscytosanalys som en modell för att utvärdera inre blod-retinal barriärpermeabilitet genom att mäta förmågan hos humana retinala mikrovaskulära endotelceller att transportera pepparrotsperoxidas över celler i caveolae-medierade transcellulära transportprocesser.

Abstract

Dysfunktion i blod-retinal barriären (BRB) bidrar till patofysiologin hos flera vaskulära ögonsjukdomar, vilket ofta resulterar i retinalt ödem och efterföljande synförlust. Den inre blod-retinala barriären (iBRB) består huvudsakligen av retinalt vaskulärt endotel med låg permeabilitet under fysiologiska förhållanden. Denna egenskap av låg permeabilitet regleras tätt och upprätthålls av låga hastigheter av paracellulär transport mellan intilliggande retinala mikrovaskulära endotelceller, såväl som transcellulär transport (transcytos) genom dem. Bedömningen av retinal transcellulär barriärpermeabilitet kan ge grundläggande insikter om iBRB-integritet i hälsa och sjukdom. I denna studie beskriver vi en endotelcell (EC) transcytosanalys, som en in vitro-modell för utvärdering av iBRB-permeabilitet, med hjälp av humana retinala mikrovaskulära endotelceller (HRMECs). Denna analys bedömer HRMECs förmåga att transportera transferrin och pepparrotsperoxidas (HRP) i receptor- respektive caveolae-medierade transcellulära transportprocesser. Helt sammanflytande HRMECs odlade på poröst membran inkuberades med fluorescerande märkt transferrin (clathrinberoende transcytos) eller HRP (caveolae-medierad transcytos) för att mäta nivåerna av transferrin eller HRP som överfördes till den nedre kammaren, vilket indikerar transcytosnivåer över EC-monoskiktet. Wnt-signalering, en känd väg som reglerar iBRB, modulerades för att demonstrera den caveolae-medierade HRP-baserade transcytosanalysmetoden. EC-transcytosanalysen som beskrivs här kan ge ett användbart verktyg för att undersöka de molekylära regulatorerna för EC-permeabilitet och iBRB-integritet i vaskulära patologier och för screening av läkemedelsleveranssystem.

Introduction

Den mänskliga näthinnan är en av de högsta energikrävande vävnaderna i kroppen. Korrekt funktion av den neurala näthinnan kräver en effektiv tillförsel av syre och näringsämnen tillsammans med ett begränsat flöde av andra potentiellt skadliga molekyler för att skydda näthinnemiljön, som förmedlas via blod-retinal barriären (BRB)1. I likhet med blod-hjärnbarriären (BBB) i centrala nervsystemet fungerar BRB som en selektiv barriär i ögat och reglerar rörelsen av joner, vatten, aminosyror och socker in och ut ur näthinnan. BRB upprätthåller också retinal homeostas och dess immunprivilegium genom att förhindra exponering för cirkulationsfaktorer såsom immunceller, antikroppar och skadliga patogener2. BRB-dysfunktion bidrar till patofysiologin hos flera vaskulära ögonsjukdomar, såsom diabetisk retinopati, åldersrelaterad makuladegeneration (AMD), retinopati av prematuritet (ROP), retinal venocklusion och uveit, vilket resulterar i vasogent ödem och efterföljande synförlust 3,4,5.

BRB består av två separata barriärer för två distinkta okulära vaskulära nätverk: retinal vaskulatur och fenestrated choriocapillaris under näthinnan. Den inre BRB (iBRB) består huvudsakligen av retinala mikrovaskulära endotelceller (RMEC) som kantar retinal mikrovaskulatur, som ger näring åt de inre retinala neuronala skikten. Å andra sidan utgör retinalpigmentepitelet huvudkomponenten i den yttre BRB, som ligger mellan den neurosensoriska näthinnan och choriocapillaris2. För iBRB sker molekylär transport över RMEC genom både paracellulära och transcellulära vägar (figur 1). Den höga graden av substansselektivitet över iBRB är beroende av (i) närvaron av korsningsproteinkomplex som begränsar paracellulär transport mellan intilliggande endotelceller (ECs) och (ii) låga uttrycksnivåer av caveolae-mediatorer, transportörer och receptorer inom endotelcellerna som upprätthåller låga hastigheter av transcellulär transport 1,6,7,8 . Korsningskomplex som reglerar paracellulärt flöde består av täta korsningar (claudiner, ockludiner), vidhäftande korsningar (VE-kadheriner) och gapkorsningar (connexiner), vilket möjliggör passage av vatten och små vattenlösliga föreningar. Medan små lipofila molekyler passivt diffunderar över det inre av RMEC, regleras rörelsen av större lipofila och hydrofila molekyler av ATP-drivna transendoteliala vägar inklusive vesikulär transport och membrantransportörer 5,9.

Vesikulär transcytos kan kategoriseras som caveolinmedierad caveolär transcytos, clathrinberoende (och receptormedierad) transcytos och clathrinoberoende makropinocytos (Figur 2). Dessa vesikulära transportprocesser involverar vesiklar av olika storlek, där makropinosomer är de största (från 200-500 nm) och caveolae är de minsta (i genomsnitt 50-100 nm), medan clathrinbelagda vesiklar sträcker sig från 70-150 nm10. Caveolae är kolvformade lipidrika plasmamembraninvaginationer med en proteinbeläggning, främst bestående av caveolin-1 som binder lipidmembrankolesterol och andra strukturella och signalerande proteiner via deras caveolin-byggnadsställningsdomän11. Caveoliner arbetar tillsammans med perifert fäst cavin för att främja caveolae-stabilisering vid plasmamembranet12. Caveolar membran kan också bära receptorer för andra molekyler såsom insulin, albumin, och cirkulerande lipoproteiner inklusive high-density lipoprotein (HDL) och low-density lipoprotein (LDL) för att hjälpa deras rörelse över endotelceller13. Under utvecklingen beror bildandet av funktionell BRB på undertryckandet av EC-transcytos8. Äldre retinalt endotel har därför relativt låga nivåer av caveolae-, caveolin-1- och albuminreceptorer med avseende på andra endotelceller under fysiologiska förhållanden, vilket bidrar till dess barriäregenskaper 4,9.

Eftersom iBRB-nedbrytning är ett viktigt kännetecken för många patologiska ögonsjukdomar är det viktigt att utveckla metoder för att bedöma retinal vaskulär permeabilitet in vivo och in vitro. Dessa metoder hjälper till att ge sannolika insikter i mekanismerna för komprometterad BRB-integritet och bedöma effekten av potentiella terapeutiska mål. Nuvarande in vivo-avbildning eller kvantitativa vaskulära läckageanalyser använder vanligtvis fluorescerande (natriumfluorescein och dextran), kolorimetriskt (Evans Blue-färgämne och pepparrotsperoxidas [HRP] substrat) eller radioaktiva spårämnen14 för att detektera extravasering från vaskulaturen till omgivande näthinnevävnader med mikroskopavbildning eller i isolerat vävnadslysat. Ett idealiskt spårämne för kvantifiering av vaskulär integritet bör vara inert och tillräckligt stort för att fritt tränga igenom komprometterade kärl medan det är inneslutet i friska och intakta kapillärer. Metoder som använder natriumfluorescein eller fluoresceinisotiocyanatkonjugerad dextran (FITC-dextran) i levande fundus fluoresceinangiografi (FFA) eller isolerade retinala platta fästen används ofta för kvantifiering av retinal extravasation in vivo eller ex vivo. FITC-dextran har fördelen att det finns i olika molekylvikter från 4-70 kDa för storlekselektiva studier15,16,17. FITC-albumin (~68 kDa) är ett alternativt storskaligt proteinspårare av biologisk relevans för kärlläckagestudier18. Evans Blue-färgämne, injicerat intrakardiellt19, retro-orbitalt eller genom svansvenen 20, förlitar sig också på dess bindning med endogent albumin för att bilda en stor molekyl som kan kvantifieras genom mestadels spektrofotometrisk detektion eller, mindre vanligt, fluorescensmikroskopi i platta fästen20,21. Dessa kvantitativa eller lätta avbildningsmetoder skiljer emellertid ofta inte paracellulär transport från transendoteltransport. För den specifika analysen av transcytos med ultrastrukturell visualisering av transcytoserade vesiklar används spårmolekyler såsom HRP vanligtvis för att lokalisera transcytoserade vesiklar i endotelceller som kan observeras under ett elektronmikroskop22,23,24 (Figur 3A-C).

Utvecklingen och användningen av in vitro iBRB-modeller för att utvärdera endotelcellpermeabiliteten kan ge robust och hög genomströmningsbedömning för att komplettera in vivo-experiment och hjälpa till att undersöka molekylära regulatorer för vaskulärt läckage. Vanliga analyser för att bedöma paracellulär transport och integritet hos täta korsningar inkluderar transendotelial elektrisk resistans (TEER), ett mått på jonisk konduktans (figur 4)2,25 och in vitro-vaskulär läckageanalys med hjälp av fluorescerande spårämnenmed liten molekylvikt 26. Dessutom har transferrinbaserade transcytosanalyser som modellerar BBB använts för att utforska clathrinberoende transcytos27. Trots detta är analyser för att utvärdera BRB och, mer specifikt, retinal EC caveolar transcytos in vitro begränsade.

I denna studie beskriver vi en EC-transcytosanalys med humana retinala mikrovaskulära endotelceller (HRMECs) som en in vitro-modell för att bestämma iBRB-permeabilitet och EC-transcytos. Denna analys är beroende av HRMECs förmåga att transportera transferrin eller HRP via de receptormedierade respektive caveolae-beroende transcytosvägarna (figur 2). HRMECs odlade till full sammanflöde i den apikala kammaren (dvs. filterinsats) inkuberades med fluorescerande konjugerat transferrin (Cy3-Tf) eller HRP för att mäta fluorescensintensiteten som motsvarar nivåerna av transferrin eller HRP som överfördes till bottenkammaren genom enbart EC-transcytos. Sammanflödet av cellmonolagret kan bekräftas genom att mäta TEER, vilket indikerar den snäva korsningsintegriteten25. För att demonstrera TEER- och transcytosanalystekniken användes kända molekylära modulatorer av vaskulär permeabilitet och EC-transcytos, inklusive vaskulär endoteltillväxtfaktor (VEGF)28 och de i Wnt-signalering (Wnt-ligander: Wnt3a och Norrin)29.

Protocol

Alla djurförsök godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Boston Children’s Hospital för generering av ljusmikroskopi och EM-bilder (figur 3). Protokoll för in vivo-studierna kan erhållas från Wang et al.24. Alla experiment med humana retinala mikrovaskulära endotelceller (HRMECs) godkändes av Institutional Biosafety Committee (IBC) vid Boston Children’s Hospital. 1. Beredning av reagenser<…

Representative Results

EM-bilder av retinalt vaskulärt endotel visar transcytotisk vesikulär transport och caveolära vesiklar i endotelceller in vivo.EC-transcytos kan visualiseras in vivo i näthinnans tvärsnitt med mörkbrun fällning som reflekterar HRP-innehållande blodkärl under ett ljusmikroskop (figur 3A) och som elektrontät fällning som indikerar HRP-innehållande transcytotiska vesiklar (figur 3B,C) med hjälp av ett transmis…

Discussion

BRB spelar en viktig roll i retinal hälsa och sjukdom. In vitro-tekniker som bedömer vaskulär permeabilitet har visat sig vara avgörande verktyg i studier om barriärutveckling (BRB/BBB) och funktion. Förfarandet som beskrivs här kan användas för att studera de molekylära mekanismerna som ligger till grund för EC-transcytos eller utvärdera relaterade molekylära modulatorer som påverkar BRB-permeabiliteten. In vitro EC-transcytosanalyser har flera fördelar jämfört med in vivo-analyser…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av NIH-bidrag (R01 EY028100, EY024963 och EY031765) till JC. ZW stöddes av ett Knights Templar Eye Foundation Career Starter Grant.

Materials

Biological Safety Cabinet  Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 1286
Cell culture petridish  Nest Biotechnology 704001
Centrifuge  Eppendorf 5702
Centrifuge tubes (15 mL) Corning Inc. 352097
Centrifuge tubes (50 mL) Denville Scientific Inc. C1062-P
Cyanine 3-human Transferrin  Jackson ImmunoResearch AB_2337082
Endothelial Cell Basal Medium-2 (EBM-2) Lonza Bioscience CC-3156
Endothelial Cell Growth Medium-2 (EGM-2) SingleQuots supplements Lonza Bioscience CC-4176
EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2) Millipore MERS00002
Fetal Bovine Serum (FBS) Lonza Bioscience CC-4102B
Gelatin Sigma-Aldrich G7765
Hemocytometer (2-chip) Bulldog Bio DHC-N002
Horseradish Peroxidase (HRP) Sigma-Aldrich P8250
Human retinal microvascular endothelial cells (HRMEC) Cell Systems ACBRI 181
Incubator Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific 3110
L cells (for Control-conditioned medium) ATCC CRL-2648
L Wnt-3A cells (for Wnt3A-conditioned medium) ATCC CRL-2647
Light microscope Leica DMi1
Multimode Plate Reader EnSight, PerkinElmer
Phosphate-buffered saline (PBS) buffer (1x) GIBCO 10010-023
QuantaBlu Fluorogenic Peroxidase Substrate kit Thermo Fisher Scientific 15169
Recombinant human Norrin (rhNorrin) R&D Systems 3014-NR
Recombinant human Vascular endothelial growth factor (rhVEGF) R&D Systems 293-VE
Syringe filter (0.22 µm) Millipore SLGP033RS
Transwell inserts (6.5 mm transwell, 0.4 µm pore polyester membrane insert) Corning Inc. CLS3470-48EA
Trypsin-EDTA (0.25%) (1x) GIBCO 25-200-072
Water bath Precision, Thermo Fisher Scientific 51221060
XAV939 (Wnt/β-catenin Inhibitor) Selleckchem S1180
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Diaz-Coranguez, M., Ramos, C., Antonetti, D. A. The inner blood-retinal barrier: Cellular basis and development. Vision Research. 139, 123-137 (2017).
  2. Campbell, M., Humphries, P. The blood-retina barrier: Tight junctions and barrier modulation. Advances in Experimental Medicine and Biology. 763, 70-84 (2012).
  3. Chen, J., et al. Wnt signaling mediates pathological vascular growth in proliferative retinopathy. Circulation. 124 (17), 1871-1881 (2011).
  4. Klaassen, I., Van Noorden, C. J., Schlingemann, R. O. Molecular basis of the inner blood-retinal barrier and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Progress in Retinal and Eye Research. 34, 19-48 (2013).
  5. Yemanyi, F., Bora, K., Blomfield, A. K., Wang, Z., Chen, J. Wnt signaling in inner blood-retinal barrier maintenance. International Journal of Molecular Sciences. 22 (21), 11877 (2021).
  6. Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. Tight junctions of the outer blood retina barrier. International Journal of Molecular Sciences. 21 (1), 211 (2019).
  7. Erickson, K. K., Sundstrom, J. M., Antonetti, D. A. Vascular permeability in ocular disease and the role of tight junctions. Angiogenesis. 10 (2), 103-117 (2007).
  8. Chow, B. W., Gu, C. Gradual suppression of transcytosis governs functional blood-retinal barrier formation. Neuron. 93 (6), 1325-1333 (2017).
  9. Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
  10. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  11. Rothberg, K. G., et al. Caveolin, a protein component of caveolae membrane coats. Cell. 68 (4), 673-682 (1992).
  12. Kovtun, O., Tillu, V. A., Ariotti, N., Parton, R. G., Collins, B. M. Cavin family proteins and the assembly of caveolae. Journal of Cell Science. 128 (7), 1269-1278 (2015).
  13. Wolburg, H., Dermietzel, R., Spray, D. C., Nedergaard, M. The Endothelial Frontier. Blood-Brain Interface: From Ontogeny to Artificial Barriers. , 75-107 (2006).
  14. Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. D. Markers for blood-brain barrier integrity: How appropriate is Evans blue in the twenty-first century and what are the alternatives. Frontiers in Neuroscience. 9, 385 (2015).
  15. Atkinson, E. G., Jones, S., Ellis, B. A., Dumonde, D. C., Graham, E. Molecular size of retinal vascular leakage determined by FITC-dextran angiography in patients with posterior uveitis. Eye. 5, 440-446 (1991).
  16. Natarajan, R., Northrop, N., Yamamoto, B. Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran extravasation as a measure of blood-brain barrier permeability. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-15 (2017).
  17. Comin, C. H., Tsirukis, D. I., Sun, Y., Xu, X. Quantification of retinal blood leakage in fundus fluorescein angiography in a retinal angiogenesis model. Scientific Reports. 11 (1), 19903 (2021).
  18. Pietra, G. G., Johns, L. W. Confocal- and electron-microscopic localization of FITC-albumin in H2O2-induced pulmonary edema. Journal of Applied Physiology. 80 (1), 182-190 (1996).
  19. Honeycutt, S. E., O’Brien, L. L. Injection of Evans blue dye to fluorescently label and image intact vasculature. Biotechniques. 70 (3), 181-185 (2021).
  20. Wu, J. H., et al. Inhibition of Sema4D/PlexinB1 signaling alleviates vascular dysfunction in diabetic retinopathy. European Molecular Biology Organization (EMBO) Molecular Medicine. 12 (2), 10154 (2020).
  21. Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. Journal of Visualized Experiments. (73), e50062 (2013).
  22. Vinores, S. A. Assessment of blood-retinal barrier integrity. Histology and Histopathology. 10 (1), 141-154 (1995).
  23. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  24. Wang, Z., et al. Wnt signaling activates MFSD2A to suppress vascular endothelial transcytosis and maintain blood-retinal barrier. Science Advances. 6 (35), (2020).
  25. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20 (2), 107-126 (2015).
  26. Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium". Methods in Enzymology. 443, 137-153 (2008).
  27. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
  28. Feng, Y., et al. VEGF-induced permeability increase is mediated by caveolae. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 40 (1), 157-167 (1999).
  29. Wang, Z., Liu, C. H., Huang, S., Chen, J. Wnt signaling in vascular eye diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 70, 110-133 (2019).
  30. Suarez, S., et al. Modulation of VEGF-induced retinal vascular permeability by peroxisome proliferator-activated receptor-beta/delta. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 55 (12), 8232-8240 (2014).
  31. Tomita, Y., et al. Long-acting FGF21 inhibits retinal vascular leakage in in vivo and in vitro models. International Journal of Molecular Science. 21 (4), 1188 (2020).
  32. Tuma, P., Hubbard, A. L. Transcytosis: Crossing cellular barriers. Physiological Reviews. 83 (3), 871-932 (2003).
  33. Moleiro, A. F., Conceicao, G., Leite-Moreira, A. F., Rocha-Sousa, A. A critical analysis of the available in vitro and ex vivo methods to study retinal angiogenesis. Journal of Ophthalmology. 2017, 3034953 (2017).
  34. Tucker, S. P., Melsen, L. R., Compans, R. W. Migration of polarized epithelial cells through permeable membrane substrates of defined pore size. European Journal of Cell Biology. 58 (2), 280-290 (1992).
  35. Butor, C., Davoust, J. Apical to basolateral surface area ratio and polarity of MDCK cells grown on different supports. Experimental Cell Research. 203 (1), 115-127 (1992).
  36. Villars, F., et al. Ability of various inserts to promote endothelium cell culture for the establishment of coculture models. Cell Biology and Toxicology. 12 (4-6), 207-214 (1996).
  37. Liu, F., Soares, M. J., Audus, K. L. Permeability properties of monolayers of the human trophoblast cell line BeWo. American Journal of Physiology. 273 (5), 1596-1604 (1997).
  38. Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30 (3), 228-234 (2003).
  39. Felix, K., Tobias, S., Jan, H., Nicolas, S., Michael, M. Measurements of transepithelial electrical resistance (TEER) are affected by junctional length in immature epithelial monolayers. Histochemistry and Cell Biology. 156 (6), 609-616 (2021).
  40. Senger, D. R., et al. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 219 (4587), 983-985 (1983).
  41. Antonetti, D. A., Barber, A. J., Hollinger, L. A., Wolpert, E. B., Gardner, T. W. Vascular endothelial growth factor induces rapid phosphorylation of tight junction proteins occludin and zonula occluden 1. A potential mechanism for vascular permeability in diabetic retinopathy and tumors. Journal of Biological Chemistry. 274 (33), 23463-23467 (1999).
  42. Argaw, A. T., Gurfein, B. T., Zhang, Y., Zameer, A., John, G. R. VEGF-mediated disruption of endothelial CLN-5 promotes blood-brain barrier breakdown. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (6), 1977-1982 (2009).
  43. Penn, J. S., et al. Vascular endothelial growth factor in eye disease. Progress in Retinal and Eye Research. 27 (4), 331-371 (2008).
  44. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  45. Roberts, R. L., Fine, R. E., Sandra, A. Receptor-mediated endocytosis of transferrin at the blood-brain barrier. Journal of Cell Science. 104, 521-532 (1993).
  46. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Malik, A. B. Molecular determinants of endothelial transcytosis and their role in endothelial permeability. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 293 (4), 823-842 (2007).
  47. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  48. Pulgar, V. M. Transcytosis to cross the blood brain barrier, new advancements and challenges. Frontiers in Neuroscience. 12, 1019 (2018).
  49. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  50. Maurissen, T. L., et al. Microphysiological neurovascular barriers to model the inner retinal microvasculature. Journal of Personalized Medicine. 12 (48), 148 (2022).

Tags

Keywords: Endothelial Cell Transcytosis AssayIn Vitro ModelBlood-retinal Barrier PermeabilityVascular BiologyEye ResearchBrain ResearchBlood-brain BarrierTEER MeasurementCell CultureHuman Retinal Microvascular Endothelial CellsHRMECsCell SeedingCell Culture Filter InsertsGelatin Coating
check_url/pt/64076?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Bora, K., Wang, Z., Yemanyi, F., Maurya, M., Blomfield, A. K., Tomita, Y., Chen, J. Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability. J. Vis. Exp. (184), e64076, doi:10.3791/64076 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image