Dit protocol beschrijft een reeks methoden voor het synthetiseren van de microgel-bouwstenen voor microporeuze gegloeide deeltjessteigers, die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan regeneratieve geneeskundetoepassingen.
Het microporeuze gegloeide deeltjes (MAP) steigerplatform is een subklasse van granulaire hydrogels. Het bestaat uit een injecteerbare slurry van microgels die een structureel stabiele steiger kan vormen met porositeit op celschaal in situ na een secundaire op licht gebaseerde chemische crosslinking-stap (d.w.z. gloeien). MAP scaffold heeft succes getoond in een verscheidenheid aan toepassingen voor regeneratieve geneeskunde, waaronder dermale wondgenezing, stemplooivergroting en stamcelafgifte. Dit artikel beschrijft de methoden voor synthese en karakterisering van poly(ethyleenglycol) (PEG) microgels als de bouwstenen om een MAP-steiger te vormen. Deze methoden omvatten de synthese van een aangepast gloeiend macromeer (MethMAL), bepaling van microgel precursor gelation kinetica, microfluïdische apparaat fabricage, microfluïdische generatie van microgels, microgel zuivering en basis scaffold karakterisering, inclusief microgel sizing en scaffold annealing. In het bijzonder kunnen de microfluïdische methoden met hoge doorvoer die hierin worden beschreven, grote hoeveelheden microgels produceren die kunnen worden gebruikt om MAP-steigers te genereren voor elke gewenste toepassing, vooral op het gebied van regeneratieve geneeskunde.
Het MAP-steigerplatform is een injecteerbaar biomateriaal dat volledig bestaat uit hydrogelmicrodeeltjes (microgels) die microporositeit op celschaal bieden wanneer ze aan elkaar worden gekoppeld, wat afbraakonafhankelijke celmigratie en bulkweefselintegratie mogelijk maakt1. Vanwege het vermogen om snel te integreren met gastheerweefsel en de inherent lage immunogeniciteit, heeft het MAP-steigerplatform preklinische toepasbaarheid aangetoond voor een breed scala aan regeneratieve geneeskundetherapieën 2,3,4,5,6,7,8,9,10, inclusief het versnellen van dermale wondgenezing 1,3 ,11, revasculariseren van herseninfarctholte7, het leveren van mesenchymale stamcellen2 en het verstrekken van weefselophoping om glottische insufficiëntie te behandelen6. Van MAP is ook aangetoond dat het ontstekingsremmende effecten overbrengt op gastheerweefsel door de rekrutering van M2-macrofagen3 en kan zelfs worden afgestemd om een Th2 “weefselherstel” immuunrespons te bevorderen8. Deze gunstige eigenschappen van het MAP-steigerplatform maken het mogelijk om het uit te breiden naar een breed scala aan klinische toepassingen.
Eerder gepubliceerde methoden voor het genereren van microgels voor MAP-steigervorming omvatten flow-focusing droplet-microfluidics 1,4,7,9, electrospraying 5,12 pt overhead spinning met batch-emulsie 6,10. De druppelmicrofluïdische methode kan deeltjes met een hoge monodispersiteit produceren, maar maakt gebruik van zeer langzame stroomsnelheden die lage opbrengsten van deeltjes (μL / h) produceren. Als alternatief kunnen de elektrospraying- en batch-emulsiemethoden een hoog volume deeltjes produceren, maar met een hoge deeltjespolydispersiteit. Dit protocol maakt gebruik van een high-throughput microfluïdische methode om microgels te produceren met een monodisperse populatie, gebaseerd op werk van de Rutte et al13. Deze methode maakt gebruik van zachte lithografietechnieken om een polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdisch apparaat te maken van een fotomasker, dat vervolgens wordt gebonden aan een glazen dia. Het ontwerp van het apparaat is gebaseerd op stapemulgering om een groot volume microgeldeeltjes (ml / h) te genereren. De monodispersiteit die met deze methode kan worden bereikt, biedt een superieure controle van porositeit in vergelijking met andere technieken, omdat monodisperse microgels steigers kunnen vormen met meer uniforme poriegroottes2.
De methoden voor het synthetiseren en karakteriseren van de individuele microgels die kunnen fungeren als bouwstenen voor MAP-steigers worden in dit manuscript geschetst, met name in termen van het maken van microgels die bestaan uit een PEG-ruggengraat met een maleimide (MAL) -groep, die gemakkelijk deelneemt aan efficiënte Michael-type toevoeging met thiol-gefunctionaliseerde crosslinkers voor microgelgelation. Om microgelgelation los te koppelen van MAP scaffold annealing, beschrijft dit manuscript ook hoe een gepubliceerd14 aangepast gloeiend macromeer, MethMAL, kan worden gesynthetiseerd, een heterofunctioneel methacrylamide / maleimide 4-arm PEG-macromeer. De functionele groepen van methacrylamide nemen gemakkelijk deel aan fotopolymerisatie van vrije radicalen (voor microgelgloeien), terwijl ze relatief inert blijven voor de omstandigheden die Michael-type toevoeging voor de MAL-functionele groepen bevorderen.
Bovendien schetst dit manuscript de protocollen voor het maken van PDMS-microfluïdische apparaten, het bepalen van microgelgelation kinetica en het karakteriseren van microgelgrootte. Het laatste deel van het manuscript beschrijft map steigergloeien, dat is wanneer de microgels in situ worden overgezet in een bulksteiger door middel van een secundaire, foto-geïnitieerde crosslinking-stap die de oppervlakken van de microgels covalent aan elkaar bindt. Het is belangrijk op te merken dat er andere gloeimethoden zijn die kunnen worden geïmplementeerd in MAP-steigersystemen die niet afhankelijk zijn van op licht gebaseerde chemicaliën, zoals enzymgemedieerd gloeien, zoals eerder beschreven1. Over het algemeen kunnen deze methoden direct worden gebruikt of worden gebruikt met verschillende hydrogelformuleringschemie (bijvoorbeeld op basis van hyaluronzuur) om MAP-steigers voor elke toepassing te genereren.
Dit protocol beschrijft methoden voor het synthetiseren en karakteriseren van microgels, die dienen als de bouwstenen voor microporeuze gegloeide deeltjes (MAP) scaffolds. Dit protocol maakt gebruik van een microfluïdische benadering met hoge doorvoer om grote hoeveelheden uniforme microgels te genereren, wat niet kan worden bereikt met andere methoden zoals flow-focusing microfluidics 1,4,7,9 (hoge monodisperisty, lage opbrengst), batch-emulsie 6,10 en elektrospraying 5,12 (lage monodispersiteit, hoge opbrengst). Met de hierin beschreven methoden kunnen monodisperse microgels worden gemaakt voor gebruik in MAP-steigers die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan regeneratieve geneeskundetoepassingen (bijv. Celafgifte, wondgenezing).
Een cruciale stap van dit protocol is het maken van de PDMS microfluïdische apparaten. Als de apparaten niet correct zijn gemaakt, kan dit negatieve stroomafwaartse effecten hebben op de vorming van microgel en monodispersiteit. Het is belangrijk om de introductie van artefacten (d.w.z. bellen, stof) in het PDMS te voorkomen voordat het uithardt, omdat dit de kanalen kan verstoppen en de vorming van microgel aanzienlijk kan beïnvloeden. Om dit zoveel mogelijk te beperken, moet men tape gebruiken om stof te verwijderen, de apparaten in een stofvrije container op te slaan en indien mogelijk in een stofvrije kap te werken. Het wordt ook aanbevolen om de apparaten op 60 °C te bewaren voor het beste resultaat met de oppervlaktebehandeling.
Bij het gieten van de PDMS-apparaten is het belangrijk om een uniforme dikte te behouden die ongeveer gelijk is aan of kleiner is dan de lengte van de biopsiepons. Als het apparaat te dik is, kan de biopsiepunch niet helemaal doordringen. Het is ook cruciaal om de in- en uitlaat van het PDMS-apparaat niet te scheuren tijdens het ponsen met de biopsiepunch en / of het inbrengen van slangen. Een scheur in het PDMS-apparaat veroorzaakt lekkage uit de in- / uitlaat, wat verlies van de gelprecursoroplossing kan veroorzaken. Als er lekken zijn in een PDMS-apparaat, is de beste oplossing om het zo snel mogelijk te vervangen door een nieuw apparaat.
Bij plasmabehandeling van het apparaat heeft het gebruik van zuivere zuurstof en plasmabehandeling gedurende 30 s de beste resultaten opgeleverd voor het hechten van PDMS aan de glasplaat. Als het apparaat niet correct hecht (d.w.z. het PDMS kan na plasmabehandeling nog steeds van de glasschuif worden getild), moet men dubbel controleren of de plasmabehandelaar correct werkt en of het apparaat en de dia’s grondig zijn gereinigd. Het is ook belangrijk om de juiste silaan oppervlaktebehandeling te gebruiken en voor de beste resultaten moeten de PDMS-apparaten direct voor gebruik aan het oppervlak worden behandeld. Andere methoden van oppervlaktebehandeling, zoals chemische dampafzetting, kunnen ook worden gebruikt.
Een andere cruciale stap is het correct gebruik van de PDMS-microfluïdische apparaten voor microgelvorming. Het wordt aanbevolen om een debietverhouding van ten minste 2: 1 te gebruiken (dit protocol gebruikt een oliedebiet van 6 ml / h en een waterig debiet van 3 ml / h), maar dit kan worden afgestemd om de gewenste microgelgrootte te bereiken. De pH van de microgel precursor oplossing is ook een belangrijke metriek om te optimaliseren om verstopping van het apparaat te voorkomen. Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) versnelt thiolaatvorming in michael-type additiechemie, en de PBS-concentraties die in dit protocol worden gebruikt, leveren de beste resultaten op voor microgelgelation in de microfluïdische apparaten. Zodra de spuitpompen zijn gestart, kunnen er enkele bubbels in de microfluïdische kanalen zijn, maar dit zou na een paar minuten in evenwicht moeten zijn. Het wordt aanbevolen om de vorming van microgel met een microscoop te controleren. Als de stroming er niet hetzelfde uitziet als in deze video en/of als er een paar kanalen zijn die grote deeltjes produceren, is dit waarschijnlijk te wijten aan problemen met de oppervlaktebehandelingsstap. De beste oplossing is om het apparaat te vervangen door een apparaat dat vers aan het oppervlak is behandeld.
Als de microgels lijken samen te smelten, kan dit te wijten zijn aan een onvoldoende concentratie FluoroSurfactant. De aanbevolen oplossing is om de wt% van de oppervlakteactieve stof in de oliefase te verhogen. Een beperking op het gebruik van hoge concentraties oppervlakteactieve stof is echter dat het moeilijker kan zijn om het tijdens de zuiveringsstap te verwijderen. Het wordt aanbevolen om microfluïdische apparaten slechts eenmaal te gebruiken, maar de apparaten kunnen opnieuw worden gebruikt als ze onmiddellijk na gebruik met Novec-olie worden gespoeld om waterige oplossing te verwijderen die in het apparaat kan gelen en de kanalen kan verstoppen. Terwijl één microfluïdisch apparaat een volume microgels met hoge doorvoer (ml / h) kan produceren, kan deze productiesnelheid worden geschaald door meerdere microfluïdische apparaten parallel te gebruiken.
De gloeistap van MAP-steigerassemblage is afhankelijk van het gebruik van een lichtgeactiveerde foto-initiator van radicale polymerisatie en de foto-initiator kan worden geselecteerd op basis van de gewenste toepassing. LAP-foto-initiator heeft bijvoorbeeld snelle gloeitijden (<30 s) bij gebruik van langgolvig UV-licht, wat een minimale impact heeft op de levensvatbaarheid van cellen in vitro14. Deze golflengte wordt echter sterk geabsorbeerd door weefsel16 en heeft in vivo mogelijk niet zo’n hoge gloeieffectiviteit als in vitro.
Eosine Y is een andere foto-initiator geactiveerd door zichtbare golflengten (505 nm) en heeft een diepere penetratie in weefsel, wat het vermogen van de MAP-steiger om onder weefsel te worden gegloeid verbetert. De lange blootstellingstijden voor licht die nodig zijn voor eosine Y-gloeien kunnen echter de blootstelling van cellen aan vrije radicalen verlengen en de levensvatbaarheid van de botscellen in vitro14 verlengen. Het gebruik van deze methoden voor high-throughput generatie van zeer uniforme microgel-bouwstenen zal map steigergericht onderzoek versnellen en kennis bevorderen op het gebied van injecteerbare poreuze materialen voor regeneratieve geneeskunde.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen Joe de Rutte en het Di Carlo Lab aan de Universiteit van Californië, Los Angeles, bedanken voor hun hulp bij het oorspronkelijke microfluïdische apparaatontwerp waaruit het gerapporteerde apparaat is ontwikkeld, evenals hun vroege begeleiding bij de fabricage en probleemoplossing van PDMS-apparaten. Figuurschema’s zijn gemaakt met Biorender.com.
2-aminoethanethiol hydrochloride | Acros Organics | AC153770250 | For MethMal Synthesis MW: 113.61 Da |
35 mm plate rotor | HAAKE | P35/Ti | Geometry for HAAKE viscometer |
4-arm PEG-Maleimide (10 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-100MA | For microgel precursor solution |
4-arm PEG-Maleimide (20 kDa) | NOF AMERICA Corporation | SUNBRIGHT PTE-200MA | For MethMal Synthesis Molecular weight specific to each batch |
BD Syringe with Luer-Lok Tips | Becton Dickinson | Disposable plastic syringes | |
Biopsy punch | Mitex | MLTX33-31A-P/25 | 1.5 mm diameter |
Chloroform-d | Acros Organics | AC209561000 | For MethMal Synthesis |
Collimated LED Light Source | ThorLabs | M365LP1-C1 | 365 nm |
Culture dish (15 cm) | Corning | CLS430599 | 150 mm x 25 mm |
DMTMM(4-(4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methyl-morpholinium chloride) | Oakwood Chemical | 151882 | For MethMal Synthesis MW: 276.72 Da |
Fluorosurfactant | Ran Technologies | 008-Flurosurfactant-5wtH-200G | 5 weight percent of 008-Flurosurfactant in HFE7500 |
FreeZone Triad Freeze Dry System | Labconco | 7400000 Series | For MethMal Synthesis Lyophilizer |
Glass slides | Fisher Scientific | 12-550-A3 | Plain glass slides, uncoated |
HAAKE Rheowin viscometer | HAAKE | ||
ImageJ | version 1.8.0_172 | ||
KDS Legato 210 Dual Prong Syringe Pump | Kd Scientific | ||
LED Driver | ThorLabs | DC2200 | |
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | Photoinitiator |
Methacrylic Acid | Sigma Aldrich | 155721 | For MethMal Synthesis MW: 86.09 Da Density: 1.015g/mL |
Microfluidic device SU8-Si master wafer | FlowJem | N/A | Custom-made, with silanization |
MMP-2 degradable crosslinker | FlowJem | Sequence: Ac-GCGPQGIAGQDGCG-NH2 | |
Needles (25 G, beveled) | BD | 305122 | Length: 15.88 mm Gauge: 0.5 mm |
Novec 7500 | 3M | 7100025016 | Fluorinated oil |
Oxygen | Praxair | UN1072 | Compressed |
Peek tubing | Trajan Scientific | 03-350-523 | 1/32" Outer Diameter; 0.02" Inner Diameter; 10' Length |
PFOCTS (trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane) | Sigma-Aldrich | 448931 | For surface treatment |
Phosphate Buffered Saline | Fisher BioReagants | BP3994 | Diluted to 1x in ultrapure water, pH = 7.4 |
Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-001-HP | |
Razor blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
RGD cell adhesive peptide | WatsonBio Sciences | Sequence: Ac-RGDSPGGC-NH2 | |
Rheowin software | HAAKE | Software compatible with HAAKE viscometer | |
Scalpel blade | Bard-Parker | 371210 | Size: #10 |
Scalpel handle | Bard-Parker | 371030 | Size: #3 |
Sodium Chloride | Fisher BioReagents | BP358-1 | For MethMal Synthesis MW: 58.44 Da |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | DOW Chemical | 2065622 | Base and curing agent |
Triethylamine | Fisher Scientific | O4884-100 | For MethMal Synthesis MW: 101.19 Da Density: 0.73g/mL |
Tygon tubing | Saint Gobain Performance Plastics | AAD04103 | ID: 0.51 mm OD: 1.52 mm |
Varian Inova 500 Spectrometer | Varian | NMR Located in the UVA Biomolecular Magnetic Resonance Facility |