Den nuværende protokol beskriver en procedure til isolering af tarmene fra voksne Caenorhabditis elegans nematodeorme i hånden til input i genomik, proteomik, mikrobiom eller andre assays.
Caenorhabditis elegans tarm består af kun 20 celler og er forbindelsen mellem mange livsstøttende funktioner, herunder fordøjelse, stofskifte, aldring, immunitet og miljørespons. Kritiske interaktioner mellem C. elegans vært og dets miljø konvergerer i tarmen, hvor tarmmikrobiota koncentrerer sig. Derfor er evnen til at isolere tarmvæv væk fra resten af ormen nødvendig for at vurdere tarmspecifikke processer. Denne protokol beskriver en metode til hånddissekering af voksne C. elegans tarme. Proceduren kan udføres i fluorescerende mærkede stammer for lethed eller træningsformål. Når teknikken er perfektioneret, kan tarmene opsamles fra umærkede orme af enhver genotype. Denne mikrodissektionsmetode giver mulighed for samtidig indfangning af værts tarmvæv og tarmmikrobiota, en fordel for mange mikrobiomundersøgelser. Som sådan kan downstream-applikationer til tarmpræparaterne, der genereres af denne protokol, omfatte, men er ikke begrænset til, RNA-isolering fra tarmceller og DNA-isolering fra fanget mikrobiota. Samlet set giver hånddissektion af C. elegans tarme en enkel og robust metode til at undersøge kritiske aspekter af tarmbiologi.
Caenorhabditis elegans nematodeorm med kun 959 celler og en 4-dages æg-til-æg-livscyklus er et ideelt modelsystem til mange genetik-, genomforsknings- og udviklingsstudier 1,2. Den lette fremadrettede og omvendte genetiske screening, forekomsten af konstruerede fluorescerende markører, kapaciteten til at udføre nukleotidspecifik genomredigering og de mange ressourcer i hele samfundet har alle bidraget til store opdagelser og indsigter i C. elegans-systemet. En betydelig ulempe er imidlertid vanskeligheden ved at opnå rene populationer af celler, væv eller organer, som er små, skrøbelige og kan sammenkobles. Da rene populationer af celler er vigtige for genomiske assays som RNA-seq, ChIP-seq og ATAC-seq, er der opstået flere tilgange til at opnå rene præparater af C. elegans celler, væv og organer. Her beskrives en metode til hånddissekering af tarme i store sektioner ud af voksne C. elegans orme. De resulterende præparater er egnede til downstream genomiske assays (figur 1).
Den finskala vævsdissektionsmetode, der er beskrevet her (figur 2), er kun en tilgang. Andre alternative teknikker – såsom molekylær mærkning, opdeling af orme og rensning af celletyper af interesse med fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) og post hoc-analyse – er også med succes blevet brugt til at undersøge de vævsspecifikke træk ved C. elegans molekylærbiologi. En fordel ved hånddissektion i forhold til disse andre tilgange er imidlertid, at den kan bruges til samtidig at udforske funktionerne i C. elegans tarm og dens bakterieindhold 3,4,5. Dette muliggør 16S rRNA-gensekventering og letter mikrobiomundersøgelser inden for C. elegans-systemet. En vigtig begrænsning er imidlertid, at tarmceller ikke isoleres individuelt.
Molekylær mærkning giver kun molekyler et celletypespecifikt mærke inden for det specificerede væv eller celler af interesse. Disse tags kan derefter isoleres fra samlede ormpræparater. På denne måde har vævsspecifikke promotorer, der driver et mærket polyA-bindende protein eller splejset leder, muliggjort vævsspecifik transkriptomprofilering 6,7,8,9,10 og 3’UTR-kortlægning 11,12. Tilsvarende er vævsspecifikke transkriptionsfaktorprofiler blevet udført ved hjælp af ChIP-seq og DamID, hvor promotorspecifikke transkriptionsfaktorvarianter blev tilføjet med tags eller enzymfusioner13,14.
FACS giver mulighed for at isolere celletyper af interesse fra dissocierede orme baseret på deres iboende cellulære egenskaber og fluorescerende egenskaber. Denne tilgang har genereret vævsspecifikke transkriptomer fra forskellige organer 8,15,16 og individuelle neuronale celletyper 8,9,15,16,17,18 og er blevet brugt til at skabe et udtrykskort over hele C. elegans nervesystem 19,20 . FACS og dets fætter fluorescensaktiverede kernesortering (FANS) er også blevet brugt til at generere cellespecifikke kromatinprofiler21,22.
Endelig kan post-hoc-analyse udføres i enkeltcelleopløsningsassays. I denne metode undersøges alle individuelle celler, celletypen for hver tilskrives i analysefasen, og celletyperne af interesse filtreres selektivt til yderligere undersøgelse. Post-hoc analyse er med succes blevet brugt til at opnå transkriptomer af udviklende celler med både høj rumlig og tidsmæssig opløsning i C. elegans embryoner 23,24,25,26,27 og L1 28 trin orme. Kromatin tilgængelighed er også blevet karakteriseret ved hjælp af ATAC-seq i stedet for RNA-seq ved hjælp af en lignende strategi29.
Hver tilgang har sine fordele og begrænsninger. For C. elegans tarm er ormopdeling og FACS-isolering af tarmceller opnåelig i embryo- og larvestadierne30, men er udfordrende hos voksne. Dette menes at skyldes tarmens store, endo-reduplicated og stærkt klæbende celler, der gør dem vanskelige at adskille ubeskadiget. Den her beskrevne hånddissektionsmetode omgår disse udfordringer og giver mulighed for isolering af store dele af den voksne orms tarm. Praksis med hånddissekering af gonader fra samme stadium er udbredt og ligetil. Tarmens dissektion ligner gonaddissektion, men udføres mindre almindeligt32. Protokollen, der præsenteres her, er tilpasset fra en længere, upubliceret protokol udviklet af Dr. James McGhee og Barb Goszczynski. Denne strømlinede protokol låner teknikker til isolering af blastomerer fra tidlige embryoner 23,33,34,35. Selvom hånddissektion ikke er mulig til isolering af de fleste celle- eller vævstyper i C. elegans, er den ideel til isolering af tarme fra voksne orme. Derfor supplerer hånddissektion andre midler til opnåelse af tarmspecifikke cellepræparater.
Denne artikel beskriver den trinvise protokol for hånddissekering af tarme fra voksne C. elegans, der genererer rene præparater til nedstrøms assays. Kritiske trin i denne protokol omfatter (1) sikring af ikke at overlamme ormene, (2) at foretage nøjagtige dissektionsskæringer, (3) smedning af mikropipetter af passende størrelse til dissektion og (4) sikring af hurtig genopretning af sunde tarme under den endelige høst. Af disse grunde skal man være forsigtig, når man udsætter orme for levamisolopløsningen, og de hypodermiske nåle skal opdateres ofte for at sikre maksimal skarphed. Håndtering af tarmen ved hjælp af mikrokapillærpipetten og mundaspiratoren er et andet trin, der vil tage øvelse. Korrekt smedede mikropipetter af passende størrelse gør også en væsentlig forskel ved at isolere store dele af tarmen under dissektioner ud over at reducere risikoen for at miste tarmene i mikropipetten. Nye protokolbrugere mister ofte tarmene på indersiden af mikrokapillærpipetten, før de kan skubbes ud i isolationsreagenset. Dette problem kan ændres med praksis og korrekt smedede mikrokapillærpipetter.
Protokollen beskrevet heri blev designet til brug i voksne orme. Foreløbige forsøg understøtter, at denne protokol også er effektiv til brug i L4 orme og ældre voksne orme. Effekten af denne protokol er imidlertid endnu ikke blevet evalueret i orme i det tidlige larvestadium. En begrænsning af denne tilgang er den lille mængde materiale, den giver. Selvom mængderne er tilstrækkelige til RNA-seq og PCR, er de muligvis ikke tilstrækkelige til andre assays. Som sådan skal brugerne afgøre, om det mindste krævede input til et assay kan indsamles med denne protokol.
Vores laboratorium bruger rutinemæssigt FACS til at rense tarmceller efter isolering 30, post-hoc analysemetoder til identifikation af tarmceller og denne hånddissektionsmetode30,42. Hånddissektion har den fordel, at den kan bruges i voksne orme, når ormopdeling og celleisolering er mindre vellykkede. Desuden er effektiviteten og kvaliteten af total RNA ekstraheret fra hånddissektionspræparater høj, sandsynligvis fordi vævene hurtigt plukkes fra ormene og derefter hurtigt deponeres i et nukleinsyreisoleringsreagens, hvilket reducerer RNA-nedbrydning. En anden fordel ved hånddissektionsmetoden er, at den er billig, let at lære og ikke kræver specialudstyr. Endelig giver denne tilgang mulighed for høst og isolering af tarmbakterier fra ormtarme, hvilket muliggør downstream mikrobiomundersøgelser.
Hånddissektionsprotokollen beskrevet her til isolering af tarme fra voksne C. elegans repræsenterer et kraftfuldt værktøj til at studere forskellige aspekter af C. elegans biologi . For eksempel kan forskere med en ren forberedelse af tarmene undersøge skæringspunktet mellem immunitet, aldring, stofskifte og mikrobiomet.
The authors have nothing to disclose.
Vi står i gæld til James McGhee og Barb Goszczynskis pionerarbejde, som oprindeligt udviklede tarmdissektionsmetoden, hvorfra denne protokol er tilpasset. Vores arbejde understøttes af en MIRA (R35) Award overvåget af National Institute of General Medical Sciences (National Institutes of Health, R35GM124877 til EON) og en NSF-CAREER Award overvåget af NSF MCB Div Of Molecular and Cellular Bioscience (Award #2143849 til EON).
Acetylated Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-420 | Nuclease free BSA |
CL2122 worm strain | CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | CL2122 | dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vector) + (pCL26) mtl-2::GFP]. Control strain for CL2120. Phenotype apparently WT. |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher | C79 | needed for making Egg Salts |
50 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-108 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
15 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-103 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
Concavity slide (2-well) | Electron Microscopy Sciences | 71878-08 | 12-pk of 2-well concavity slides |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Millipore Sigma | E3889 | needed for making chelation buffer |
Fluorescent Dissection Microscope | Leica | M205 FCA | This is an optional piece of equipment that can be used with fluorescent C. elegans strains to help guid users during hand dissections |
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Millipore Sigma | H4034 | needed for making dissection buffer |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | for assesment of total RNA quality and quantity |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | for assesment of total RNA quality and quantity |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | for assesment of total RNA quality and quantity |
HostZERO Microbial DNA Kit | Zymo Research | D4310 | Isolation of microbial DNA from worm intestines/worms |
Hypodermic Needle (27G x 1/2") | BD Scientific | 305109 | needed for hand dissection of intestines |
Levamisole (a.k.a. (-)-Tetramisole hydrochloride) | Millipore Sigma | L9756 | used to temporarily paralyze worms prior to hand dissection of intestines. |
Luer-Lok General Use Disposable Syringe (1 mL) | BD Scientific | 309628 | Optional. Can be used to affix the hypodermic needle to, allowing easier manipulation of the needle during dissection. Remove the plunger. |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher | M33 | needed for making Egg Salts |
Magnesium Sulfate Hpetahydrate | Sigma-Aldrich | 230391-500G | needed for making M9 buffer |
MF-900 Microforge | Narishige | MF-900 | Used to forge the microcapillary pipettes. Available through Tritech Research. |
1.7 mL Microtubes, Clear | Olympus Plastics | 22-282 | Nuclease free microfuge tube needed for solution making and sample storage. |
Mouth Aspirator Tube | Millipore Sigma | A5177 | Mouth aspirator tube is needed in combination with the microcapillary pipette to allow aspiration of dissected intestines. |
16S Pan-Bacterial Control TaqMan Assay | Thermo Fisher | A50137 | Assay ID: Ba04930791_s1. Assay used for gut microbial detection via qPCR. |
P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | Used to pull the microcapillary pippettes prior to forging. |
Petri Dish (35 x 10 mm) | Genesee Scientific – Olympus Plastics | 32-103 | Used to make M9 bath and Disseciton Buffer bath for washing worms prior to dissection. |
Phenol:Chloroform:IAA | Ambion | AM9730 | Used in the isolation of total RNA |
Potassium Chloride | Millipore Sigma | 529552 | needed for making Egg Salts |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P0662-500G | needed for making M9 buffer |
Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Accompanies the Qubit RNA HS Assay Kit. Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
Qubit RNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32852 | Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | Broad spectrum inhibition of common eukaryotic Rnases |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | used for on-column DNA digestion during RNA isolation protocol. |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Used for isolation of total RNA from worm intestines/worms |
Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 4 in OD 1.2 mm standard borosilicate glass capillaries used to make microcapillary pipettes for dissection |
Sodium Chloride | Fisher | S271 | needed for making Egg Salts |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | needed for making M9 buffer |
Syringe filter (0.2 micrometer SCFA) | Thermo Fisher | 72302520 | Optional for use with the mouth aspirator tube when mouth pipetting. |
4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Accompanies the RNA ScreenTape reagents for assessing RNA quality and quantity |
TaqPath BactoPure Microbial Detection Master Mix | Applied Biosystems | A52699 | master mix used for qPCR |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Nucleic acid isolation and preservation. QIAzol (Qiagen; 79306) can be substituted if preferred. |
Worm Pick | NA | NA | Made in house from a pasteur pipette and a platinum wire. See wormbook for details. |