Den nåværende protokollen beskriver en prosedyre for å isolere tarmene fra voksne Caenorhabditis elegans nematode ormer for hånd for innspill i genomikk, proteomikk, mikrobiom eller andre analyser.
Caenorhabditis elegans tarm består av bare 20 celler, og er nexus av mange livsstøttende funksjoner, inkludert fordøyelse, metabolisme, aldring, immunitet og miljørespons. Kritiske interaksjoner mellom C. elegans-verten og dens miljø konvergerer i tarmen, hvor tarmmikrobiota konsentrerer seg. Derfor er evnen til å isolere tarmvev vekk fra resten av ormen nødvendig for å vurdere tarmspesifikke prosesser. Denne protokollen beskriver en metode for hånddissekering av voksne C. elegans tarmer. Prosedyren kan utføres i fluorescerende merkede stammer for enkelhet eller treningsformål. Når teknikken er perfeksjonert, kan tarmene samles fra umerkede ormer av enhver genotype. Denne mikrodisseksjonsmetoden tillater samtidig fangst av vertstarmvev og tarmmikrobiota, en fordel for mange mikrobiomstudier. Som sådan kan nedstrømsapplikasjoner for tarmpreparatene generert av denne protokollen inkludere, men er ikke begrenset til, RNA-isolasjon fra tarmceller og DNA-isolasjon fra fanget mikrobiota. Samlet sett gir hånddisseksjon av C. elegans tarmer en enkel og robust metode for å undersøke kritiske aspekter ved tarmbiologi.
Caenorhabditis elegans nematodeorm, med bare 959 celler og en 4 dagers egg-til-egg livssyklus, er et ideelt modellsystem for mange genetikk-, genomikk- og utviklingsstudier 1,2. Den enkle genetiske screeningen fremover og omvendt, utbredelsen av konstruerte fluorescerende markører, kapasiteten til å utføre nukleotidspesifikk genomredigering og de mange samfunnsomfattende ressursene har alle bidratt til store funn og innsikt i C. elegans-systemet. En betydelig ulempe er imidlertid vanskeligheten med å skaffe rene populasjoner av celler, vev eller organer, som er små, skjøre og kan kobles sammen. Siden rene populasjoner av celler er viktige for genomikkanalyser som RNA-seq, ChIP-seq og ATAC-seq, har flere tilnærminger dukket opp for å oppnå rene preparater av C. elegans-celler, vev og organer. Her beskrives en metode for hånddissekering av tarmene, i store seksjoner, ut av voksne C. elegans ormer. De resulterende preparatene er egnet for nedstrøms genomikkanalyser (figur 1).
Finskala vevsdisseksjonsmetoden beskrevet her (figur 2) er bare én tilnærming. Andre alternative teknikker – som molekylær merking, disaggregering av ormer og rensing av celletyper av interesse med fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og post hoc-analyse – har også blitt brukt til å kartlegge de vevsspesifikke egenskapene til C. elegans molekylærbiologi. En fordel med hånddisseksjon over disse andre tilnærmingene er imidlertid at den kan brukes til samtidig å utforske funksjonene i C. elegans tarm og dens bakterielle innhold 3,4,5. Dette muliggjør 16S rRNA-gensekvensering og letter mikrobiomstudier i C. elegans-systemet. En viktig begrensning er imidlertid at tarmceller ikke isoleres individuelt.
Molekylær merking gir en celletypespesifikk tag til molekyler bare innenfor det angitte vevet eller cellene av interesse. Disse kodene kan deretter isoleres fra totale ormpreparater. På denne måten har vevsspesifikke promotorer som driver et merket polyA-bindende protein eller spleiset leder, aktivert vevsspesifikk transkriptomprofilering 6,7,8,9,10 og 3’UTR-kartlegging 11,12. Tilsvarende har vevsspesifikke transkripsjonsfaktorprofiler blitt utført ved bruk av ChIP-seq og DamID, der promotorspesifikke transkripsjonsfaktorvarianter ble lagt til med koder eller enzymfusjoner13,14.
FACS gjør det mulig å isolere celletyper av interesse fra dissosierte ormer basert på deres iboende cellulære egenskaper og fluorescerende egenskaper. Denne tilnærmingen har generert vevsspesifikke transkriptomer fra forskjellige organer 8,15,16 og individuelle nevroncelletyper 8,9,15,16,17,18 og har blitt brukt til å lage et uttrykkskart over hele C. elegans nervesystem 19,20 . FACS, og dens fetter fluorescensaktiverte kjernesortering (FANS), har også blitt brukt til å generere cellespesifikke kromatinprofiler21,22.
Endelig kan post-hoc-analyse utføres i enkeltcelleoppløsningsanalyser. I denne metoden undersøkes alle individuelle celler, celletypen til hver tilskrives i analysestadiet, og celletyper av interesse filtreres selektivt for videre studier. Post-hoc analyse har blitt brukt til å oppnå transkriptomer av utviklingsceller med både høy romlig og tidsmessig oppløsning i C. elegans embryoer 23,24,25,26,27 og L1 28 stadium ormer. Kromatintilgjengelighet har også blitt karakterisert ved bruk av ATAC-seq i stedet for RNA-seq ved hjelp av en lignende strategi29.
Hver tilnærming har sine fordeler og begrensninger. For C. elegans tarm er ormdisaggregering og FACS-isolering av tarmceller oppnåelig i embryo- og larvestadiene30, men er utfordrende hos voksne. Dette antas å skyldes tarmens store, endo-reduplikerte og sterkt adherente celler som gjør dem vanskelige å dissosiere uskadet. Hånddisseksjonsmetoden som er beskrevet her, omgår disse utfordringene, noe som muliggjør isolering av store deler av den voksne ormens tarm. Praksisen med å dissekere gonader fra samme stadium er utbredt og grei. Tarmdisseksjon ligner på gonaddisseksjon, men utføres mindre vanlig32. Protokollen som presenteres her er tilpasset fra en lengre, upublisert protokoll utviklet av Dr. James McGhee og Barb Goszczynski. Denne strømlinjeformede protokollen låner teknikker for å isolere blastomerer fra embryoer i tidlig stadium 23,33,34,35. Selv om hånddisseksjon ikke er mulig for å isolere de fleste celle- eller vevstyper i C. elegans, er den ideell for å isolere tarmene fra voksne ormer. Derfor kompletterer hånddisseksjon andre midler for å oppnå tarmspesifikke cellepreparater.
Denne artikkelen beskriver trinn-for-trinn-protokollen for hånddissekering av tarmene fra voksne C. elegans, som genererer rene preparater for nedstrøms analyser. Kritiske trinn i denne protokollen inkluderer (1) å sikre ikke å lamme ormene, (2) å gjøre nøyaktige disseksjonskutt, (3) smi mikropipetter av passende størrelse for disseksjon, og (4) sikre rask gjenoppretting av sunne tarmer under den endelige høsten. Av disse grunner må det utvises forsiktighet når ormer utsettes for levamisoloppløsningen, og hypodermiske nåler må oppdateres ofte for å sikre maksimal skarphet. Håndtering av tarmen ved hjelp av mikrokapillærpipetten og munnaspiratoren er et annet skritt som vil ta praksis. Riktig smidde mikropipetter av passende størrelse gjør også en betydelig forskjell i å isolere store deler av tarmen under disseksjoner, i tillegg til å redusere risikoen for å miste tarmene i mikropipetten. Nye protokollbrukere mister vanligvis tarmene på den indre kanten av mikrokapillærpipetten før de kan kastes ut i isolasjonsreagenset. Dette problemet kan endres med praksis og riktig smidde mikrokapillære pipetter.
Protokollen beskrevet her ble designet for bruk i voksne ormer. Foreløpige forsøk støtter at denne protokollen også er effektiv for bruk i L4 ormer og eldre voksne ormer. Effekten av denne protokollen er imidlertid ennå ikke evaluert i ormer i tidlig larvestadium. En begrensning av denne tilnærmingen er den lille mengden materiale det gir. Selv om mengdene er tilstrekkelige for RNA-seq og PCR, kan de ikke være tilstrekkelige for andre analyser. Som sådan må brukerne avgjøre om minimumskravet for en analyse kan samles inn med denne protokollen.
Vårt laboratorium bruker rutinemessig FACS for å rense tarmceller etter isolasjon 30, post-hoc analysemetoder for tarmcelleidentifikasjon, og denne hånddisseksjonsmetoden30,42. Hånddisseksjon har fordelen av å være mottagelig for bruk i voksne ormer når ormdisaggregering og celleisolasjon er mindre vellykket. Videre er effektiviteten og kvaliteten på totalt RNA ekstrahert fra hånddisseksjonspreparater høy, sannsynligvis fordi vevet raskt plukkes fra ormene og deretter raskt avsettes i et nukleinsyreisolasjonsreagens, noe som reduserer RNA-nedbrytning. En annen fordel med hånddisseksjonsmetoden er at den er billig, lett å lære og ikke krever spesialutstyr. Til slutt tillater denne tilnærmingen høsting og isolering av tarmbakterier fra orminnvoller, noe som muliggjør nedstrøms mikrobiomstudier.
Hånddisseksjonsprotokollen beskrevet her for å isolere tarmene fra voksne C. elegans representerer et kraftig verktøy for å studere ulike aspekter av C. elegans biologi . For eksempel, med en ren forberedelse av tarmene, kan forskere undersøke skjæringspunktet mellom immunitet, aldring, metabolisme og mikrobiomet.
The authors have nothing to disclose.
Vi står i gjeld til pionerarbeidet til James McGhee og Barb Goszczynski, som opprinnelig utviklet tarmdisseksjonsmetoden som denne protokollen er tilpasset fra. Vårt arbeid støttes av en MIRA (R35) Award overvåket av National Institute of General Medical Sciences (National Institutes of Health, R35GM124877 til EON) og en NSF-CAREER Award overvåket av NSF MCB Div Of Molecular and Cellular Bioscience (Award # 2143849 til EON).
Acetylated Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-420 | Nuclease free BSA |
CL2122 worm strain | CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | CL2122 | dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vector) + (pCL26) mtl-2::GFP]. Control strain for CL2120. Phenotype apparently WT. |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher | C79 | needed for making Egg Salts |
50 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-108 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
15 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-103 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
Concavity slide (2-well) | Electron Microscopy Sciences | 71878-08 | 12-pk of 2-well concavity slides |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Millipore Sigma | E3889 | needed for making chelation buffer |
Fluorescent Dissection Microscope | Leica | M205 FCA | This is an optional piece of equipment that can be used with fluorescent C. elegans strains to help guid users during hand dissections |
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Millipore Sigma | H4034 | needed for making dissection buffer |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | for assesment of total RNA quality and quantity |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | for assesment of total RNA quality and quantity |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | for assesment of total RNA quality and quantity |
HostZERO Microbial DNA Kit | Zymo Research | D4310 | Isolation of microbial DNA from worm intestines/worms |
Hypodermic Needle (27G x 1/2") | BD Scientific | 305109 | needed for hand dissection of intestines |
Levamisole (a.k.a. (-)-Tetramisole hydrochloride) | Millipore Sigma | L9756 | used to temporarily paralyze worms prior to hand dissection of intestines. |
Luer-Lok General Use Disposable Syringe (1 mL) | BD Scientific | 309628 | Optional. Can be used to affix the hypodermic needle to, allowing easier manipulation of the needle during dissection. Remove the plunger. |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher | M33 | needed for making Egg Salts |
Magnesium Sulfate Hpetahydrate | Sigma-Aldrich | 230391-500G | needed for making M9 buffer |
MF-900 Microforge | Narishige | MF-900 | Used to forge the microcapillary pipettes. Available through Tritech Research. |
1.7 mL Microtubes, Clear | Olympus Plastics | 22-282 | Nuclease free microfuge tube needed for solution making and sample storage. |
Mouth Aspirator Tube | Millipore Sigma | A5177 | Mouth aspirator tube is needed in combination with the microcapillary pipette to allow aspiration of dissected intestines. |
16S Pan-Bacterial Control TaqMan Assay | Thermo Fisher | A50137 | Assay ID: Ba04930791_s1. Assay used for gut microbial detection via qPCR. |
P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | Used to pull the microcapillary pippettes prior to forging. |
Petri Dish (35 x 10 mm) | Genesee Scientific – Olympus Plastics | 32-103 | Used to make M9 bath and Disseciton Buffer bath for washing worms prior to dissection. |
Phenol:Chloroform:IAA | Ambion | AM9730 | Used in the isolation of total RNA |
Potassium Chloride | Millipore Sigma | 529552 | needed for making Egg Salts |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P0662-500G | needed for making M9 buffer |
Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Accompanies the Qubit RNA HS Assay Kit. Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
Qubit RNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32852 | Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | Broad spectrum inhibition of common eukaryotic Rnases |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | used for on-column DNA digestion during RNA isolation protocol. |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Used for isolation of total RNA from worm intestines/worms |
Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 4 in OD 1.2 mm standard borosilicate glass capillaries used to make microcapillary pipettes for dissection |
Sodium Chloride | Fisher | S271 | needed for making Egg Salts |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | needed for making M9 buffer |
Syringe filter (0.2 micrometer SCFA) | Thermo Fisher | 72302520 | Optional for use with the mouth aspirator tube when mouth pipetting. |
4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Accompanies the RNA ScreenTape reagents for assessing RNA quality and quantity |
TaqPath BactoPure Microbial Detection Master Mix | Applied Biosystems | A52699 | master mix used for qPCR |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Nucleic acid isolation and preservation. QIAzol (Qiagen; 79306) can be substituted if preferred. |
Worm Pick | NA | NA | Made in house from a pasteur pipette and a platinum wire. See wormbook for details. |