Detta protokoll beskriver ett förfarande för att isolera tarmar från vuxna Caenorhabditis elegans nematodmaskar för hand för inmatning i genomik, proteomik, mikrobiom eller andra analyser.
Caenorhabditis elegans tarm består av endast 20 celler och är kopplingen mellan många livsuppehållande funktioner, inklusive matsmältning, metabolism, åldrande, immunitet och miljörespons. Kritiska interaktioner mellan C. elegans-värden och dess miljö konvergerar i tarmen, där tarmmikrobiota koncentreras. Därför är förmågan att isolera tarmvävnad bort från resten av masken nödvändig för att bedöma tarmspecifika processer. Detta protokoll beskriver en metod för handdissekering av vuxna C. elegans tarmar. Förfarandet kan utföras i fluorescerande märkta stammar för enkelhets- eller träningsändamål. När tekniken är fulländad kan tarmarna samlas in från omärkta maskar av vilken genotyp som helst. Denna mikrodissektionsmetod möjliggör samtidig fångst av värdens tarmvävnad och tarmmikrobiota, en fördel för många mikrobiomstudier. Som sådan kan nedströmsapplikationer för tarmpreparaten som genereras av detta protokoll inkludera men är inte begränsade till RNA-isolering från tarmceller och DNA-isolering från fångad mikrobiota. Sammantaget ger handdissektion av C. elegans tarmar en enkel och robust metod för att undersöka kritiska aspekter av tarmbiologi.
Caenorhabditis elegans nematodmask, med bara 959 celler och en 4-dagars ägg-till-ägg-livscykel, är ett idealiskt modellsystem för många genetik-, genomik- och utvecklingsstudier 1,2. Lättheten av framåt- och omvänd genetisk screening, förekomsten av konstruerade fluorescerande markörer, förmågan att utföra nukleotidspecifik genomredigering och de många samhällsomfattande resurserna har alla bidragit till stora upptäckter och insikter i C. elegans-systemet. En signifikant nackdel är emellertid svårigheten att erhålla rena populationer av celler, vävnader eller organ, som är små, bräckliga och kan vara sammankopplade. Eftersom rena populationer av celler är viktiga för genomikanalyser som RNA-seq, ChIP-seq och ATAC-seq, har flera metoder uppstått för att erhålla rena preparat av C. elegans-celler, vävnader och organ. Här beskrivs en metod för handdissekering av tarmar, i stora delar, ur vuxna C. elegans-maskar. De resulterande preparaten är lämpliga för genomikanalyser nedströms (figur 1).
Den finskaliga vävnadsdissektionsmetoden som beskrivs här (figur 2) är bara ett tillvägagångssätt. Andra alternativa tekniker – såsom molekylär märkning, disaggregering av maskar och renande celltyper av intresse med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och post hoc-analys – har också framgångsrikt använts för att kartlägga de vävnadsspecifika egenskaperna hos C. elegans molekylärbiologi. En fördel med handdissektion jämfört med dessa andra tillvägagångssätt är dock att den kan användas för att samtidigt utforska funktionerna i C. elegans-tarmen och dess bakterieinnehåll 3,4,5. Detta möjliggör 16S rRNA-gensekvensering och underlättar mikrobiomstudier inom C. elegans-systemet. En viktig begränsning är dock att tarmcellerna inte är individuellt isolerade.
Molekylär märkning ger en celltypspecifik tagg till molekyler endast inom den angivna vävnaden eller cellerna av intresse. Dessa taggar kan sedan isoleras från totala maskpreparat. På detta sätt har vävnadsspecifika promotorer som driver ett taggat polyA-bindande protein eller skarvad ledare möjliggjort vävnadsspecifik transkriptomprofilering 6,7,8,9,10 och 3’UTR-kartläggning 11,12. På liknande sätt har vävnadsspecifika transkriptionsfaktorprofiler utförts med hjälp av ChIP-seq och DamID, där promotorspecifika transkriptionsfaktorvarianter bifogats med taggar eller enzymfusioner13,14.
FACS möjliggör isolering av celltyper av intresse från dissocierade maskar baserat på deras inneboende cellulära egenskaper och fluorescerande egenskaper. Detta tillvägagångssätt har genererat vävnadsspecifika transkriptom från olika organ 8,15,16 och enskilda neuronala celltyper 8,9,15,16,17,18 och har använts för att skapa en uttryckskarta över hela C. elegans nervsystem 19,20 . FACS, och dess kusin fluorescensaktiverade kärnor sortering (FANS), har också använts för att generera cellspecifika kromatinprofiler21,22.
Slutligen kan post-hoc-analys utföras i encellsupplösningsanalyser. I denna metod undersöks alla enskilda celler, celltypen för var och en tillskrivs i analyssteget och celltyperna av intresse filtreras selektivt för vidare studier. Post-hoc-analys har framgångsrikt använts för att erhålla transkriptom av utvecklande celler med både hög rumslig och tidsmässig upplösning i C. elegans embryon 23,24,25,26,27 och L1 28 stegmaskar. Kromatintillgänglighet har också karakteriserats med ATAC-seq istället för RNA-seq med en liknande strategi29.
Varje tillvägagångssätt har sina fördelar och begränsningar. För C. elegans-tarmen kan maskuppdelning och FACS-isolering av tarmceller uppnås i embryo- och larvstadierna30 men är utmanande hos vuxna. Detta tros bero på tarmens stora, endo-reduplicerade och starkt vidhäftande celler som gör dem svåra att dissociera oskadade. Handdissektionsmetoden som beskrivs här kringgår dessa utmaningar, vilket möjliggör isolering av stora delar av den vuxna maskens tarm. Bruket att handdissekera gonader från samma stadium är utbrett och enkelt. Tarmdissektion liknar gonaddissektion men utförs mindre vanligt32. Protokollet som presenteras här är anpassat från ett längre, opublicerat protokoll utvecklat av Dr. James McGhee och Barb Goszczynski. Detta strömlinjeformade protokoll lånar tekniker för att isolera blastomerer från embryon i tidigt stadium 23,33,34,35. Även om handdissektion inte är möjlig för att isolera de flesta cell- eller vävnadstyper i C. elegans, är den idealisk för att isolera tarmarna från vuxna maskar. Därför kompletterar handdissektion andra medel för att erhålla tarmspecifika cellpreparat.
Denna artikel beskriver steg-för-steg-protokollet för handdissekering av tarmar från vuxna C. elegans, vilket genererar rena preparat för nedströmsanalyser. Kritiska steg i detta protokoll inkluderar (1) att säkerställa att inte överförlama maskarna, (2) göra exakta dissektionsskärningar, (3) smida mikropipetter av lämplig storlek för dissektion och (4) säkerställa snabb återhämtning av friska tarmar under den slutliga skörden. Av dessa skäl måste försiktighet iakttas när maskar utsätts för levamisollösningen, och de hypodermiska nålarna måste uppdateras ofta för att säkerställa maximal skärpa. Att hantera tarmen med hjälp av mikrokapillärpipetten och munsugen är ett annat steg som kommer att ta övning. Korrekt smidda mikropipetter av lämplig storlek gör också en väsentlig skillnad i att isolera stora delar av tarmen under dissektioner, förutom att minska risken för att förlora tarmarna i mikropipetten. Nya protokollanvändare förlorar vanligtvis tarmar på den inre kanten av mikrokapillärpipetten innan de kan matas ut i isoleringsreagenset. Detta problem kan ändras med övning och korrekt smidda mikrokapillärpipetter.
Protokollet som beskrivs häri var utformat för användning i vuxna maskar. Preliminära försök stöder att detta protokoll också är effektivt för användning i L4-maskar och äldre vuxna maskar. Effekten av detta protokoll har emellertid ännu inte utvärderats i tidiga larvstadiemaskar. En begränsning av detta tillvägagångssätt är den lilla mängd material det ger. Även om mängderna är tillräckliga för RNA-seq och PCR, kanske de inte är tillräckliga för andra analyser. Som sådan måste användarna avgöra om den minsta nödvändiga inmatningen för en analys kan samlas in med detta protokoll.
Vårt laboratorium använder rutinmässigt FACS för att rena tarmceller efter isolering 30, post-hoc-analysmetoder för identifiering av tarmceller och denna handdissektionsmetod30,42. Handdissektion har fördelen att den är mottaglig för användning i vuxna maskar när maskuppdelning och cellisolering är mindre framgångsrika. Dessutom är effektiviteten och kvaliteten på totalt RNA extraherat från handdissektionspreparat höga, troligen eftersom vävnaderna snabbt plockas från maskarna och sedan snabbt deponeras i ett nukleinsyraisoleringsreagens, vilket minskar RNA-nedbrytningen. En annan fördel med handdissektionsmetoden är att den är låg kostnad, lätt att lära sig och inte kräver specialutrustning. Slutligen möjliggör detta tillvägagångssätt skörd och isolering av tarmbakterier från masktarmar, vilket möjliggör nedströms mikrobiomstudier.
Handdissektionsprotokollet som beskrivs här för att isolera tarmar från vuxna C. elegans representerar ett kraftfullt verktyg för att studera olika aspekter av C. elegans biologi. Till exempel, med en ren beredning av tarmar, kan forskare undersöka skärningspunkten mellan immunitet, åldrande, metabolism och mikrobiomet.
The authors have nothing to disclose.
Vi står i tacksamhetsskuld till James McGhees och Barb Goszczynskis pionjärarbete, som ursprungligen utvecklade tarmdissektionsmetoden från vilken detta protokoll anpassas. Vårt arbete stöds av en MIRA (R35) Award som övervakas av National Institute of General Medical Sciences (National Institutes of Health, R35GM124877 till EON) och ett NSF-CAREER Award som övervakas av NSF MCB Div Of Molecular and Cellular Bioscience (Award #2143849 till EON).
Acetylated Bovine Serum Albumin (BSA) | VWR | 97061-420 | Nuclease free BSA |
CL2122 worm strain | CGC (Caenorhabditis Genetics Center) | CL2122 | dvIs15 [(pPD30.38) unc-54(vector) + (pCL26) mtl-2::GFP]. Control strain for CL2120. Phenotype apparently WT. |
Calcium Chloride Dihydrate | Fisher | C79 | needed for making Egg Salts |
50 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-108 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
15 mL Centrifuge Tubes, Bulk | Olympus Plastics | 28-103 | Nuclease free conical tube needed for solution making. |
Concavity slide (2-well) | Electron Microscopy Sciences | 71878-08 | 12-pk of 2-well concavity slides |
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Millipore Sigma | E3889 | needed for making chelation buffer |
Fluorescent Dissection Microscope | Leica | M205 FCA | This is an optional piece of equipment that can be used with fluorescent C. elegans strains to help guid users during hand dissections |
N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid), 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Millipore Sigma | H4034 | needed for making dissection buffer |
High Sensitivity RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5579 | for assesment of total RNA quality and quantity |
High Sensitivity RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5581 | for assesment of total RNA quality and quantity |
High Sensitivity RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5580 | for assesment of total RNA quality and quantity |
HostZERO Microbial DNA Kit | Zymo Research | D4310 | Isolation of microbial DNA from worm intestines/worms |
Hypodermic Needle (27G x 1/2") | BD Scientific | 305109 | needed for hand dissection of intestines |
Levamisole (a.k.a. (-)-Tetramisole hydrochloride) | Millipore Sigma | L9756 | used to temporarily paralyze worms prior to hand dissection of intestines. |
Luer-Lok General Use Disposable Syringe (1 mL) | BD Scientific | 309628 | Optional. Can be used to affix the hypodermic needle to, allowing easier manipulation of the needle during dissection. Remove the plunger. |
Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher | M33 | needed for making Egg Salts |
Magnesium Sulfate Hpetahydrate | Sigma-Aldrich | 230391-500G | needed for making M9 buffer |
MF-900 Microforge | Narishige | MF-900 | Used to forge the microcapillary pipettes. Available through Tritech Research. |
1.7 mL Microtubes, Clear | Olympus Plastics | 22-282 | Nuclease free microfuge tube needed for solution making and sample storage. |
Mouth Aspirator Tube | Millipore Sigma | A5177 | Mouth aspirator tube is needed in combination with the microcapillary pipette to allow aspiration of dissected intestines. |
16S Pan-Bacterial Control TaqMan Assay | Thermo Fisher | A50137 | Assay ID: Ba04930791_s1. Assay used for gut microbial detection via qPCR. |
P-1000 Micropipette Puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | Used to pull the microcapillary pippettes prior to forging. |
Petri Dish (35 x 10 mm) | Genesee Scientific – Olympus Plastics | 32-103 | Used to make M9 bath and Disseciton Buffer bath for washing worms prior to dissection. |
Phenol:Chloroform:IAA | Ambion | AM9730 | Used in the isolation of total RNA |
Potassium Chloride | Millipore Sigma | 529552 | needed for making Egg Salts |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P0662-500G | needed for making M9 buffer |
Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Accompanies the Qubit RNA HS Assay Kit. Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
Qubit RNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32852 | Can be used to quantify RNA prior to running sample on the Agilent ScreenTape. |
RNasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | Broad spectrum inhibition of common eukaryotic Rnases |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | used for on-column DNA digestion during RNA isolation protocol. |
RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Used for isolation of total RNA from worm intestines/worms |
Standard Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 4 in OD 1.2 mm standard borosilicate glass capillaries used to make microcapillary pipettes for dissection |
Sodium Chloride | Fisher | S271 | needed for making Egg Salts |
Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Fisher Scientific | S373-500 | needed for making M9 buffer |
Syringe filter (0.2 micrometer SCFA) | Thermo Fisher | 72302520 | Optional for use with the mouth aspirator tube when mouth pipetting. |
4150 TapeStation System | Agilent | G2992AA | Accompanies the RNA ScreenTape reagents for assessing RNA quality and quantity |
TaqPath BactoPure Microbial Detection Master Mix | Applied Biosystems | A52699 | master mix used for qPCR |
TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Nucleic acid isolation and preservation. QIAzol (Qiagen; 79306) can be substituted if preferred. |
Worm Pick | NA | NA | Made in house from a pasteur pipette and a platinum wire. See wormbook for details. |