이 프로토콜은 위상 연관 도메인(TAD)의 경계 및 조절 및 기타 DNA 서열 요소 간의 장거리 염색질 상호 작용을 포함하여 고해상도에서 메가 기반 크기의 표적 게놈 영역의 3D 조직을 특성화하는 데 사용되는 Capture Hi-C 방법을 설명합니다.
게놈의 공간적 구성은 전사, 복제, 재조합 및 복구를 포함한 많은 맥락에서 게놈의 기능과 조절에 기여합니다. 따라서 게놈 토폴로지와 기능 사이의 정확한 인과 관계를 이해하는 것이 중요하며 점점 더 집중적인 연구의 주제가 되고 있습니다. 염색체 형태 캡처 기술(3C)을 사용하면 게놈의 모든 영역 간의 상호 작용 빈도를 측정하여 염색질의 3D 구조를 추론할 수 있습니다. 여기에서는 메가 기반 크기의 게놈 표적의 대립 유전자 특이적 3D 조직을 고해상도로 특성화하는 3C 기반 표적 농축 방법인 Capture Hi-C를 수행하는 빠르고 간단한 프로토콜에 대해 설명합니다. Capture Hi-C에서 타겟 영역은 다운스트림 고처리량 시퀀싱 전에 비오티닐화된 프로브 어레이에 의해 캡처됩니다. 따라서 더 높은 분해능과 대립유전자 특이성을 달성하는 동시에 기술의 시간 효율성과 경제성을 향상시킵니다. 그 강점을 입증하기 위해 Capture Hi-C 프로토콜은 X-염색체 불활성화(XCI)의 마스터 조절 유전자좌인 마우스 X-불활성화 센터 (Xic)에 적용되었습니다.
선형 게놈은 유기체가 배아 발달을 겪고 성인이 될 때까지 생존하는 데 필요한 모든 정보를 보유하고 있습니다. 그러나 유전적으로 동일한 세포가 서로 다른 기능을 수행하도록 지시하는 것은 서로 다른 조직 및/또는 발달 단계를 포함하여 특정 상황에서 사용되는 정보를 정확하게 제어하는 데 기본입니다. 게놈의 3차원 조직은 선형 게놈에서 수백 킬로베이스로 분리될 수 있는 조절 요소 간의 물리적 상호작용을 촉진하거나 방지함으로써 유전자 활성의 정확한 시공간 조절에 참여하는 것으로 생각됩니다(리뷰 1,2,3;). 지난 20년 동안 게놈 접힘과 활동 사이의 상호 작용에 대한 우리의 이해는 주로 염색체 형태 캡처 기술(3C)의 개발로 인해 급격히 증가했습니다(검토 4,5,6,7). 이 방법은 게놈의 모든 영역 간의 상호 작용 빈도를 측정하고 핵 내에서 3D로 근접한 DNA 서열의 결찰에 의존합니다. 가장 일반적인 3C 프로토콜은 포름알데히드와 같은 가교제로 세포 집단을 고정하는 것으로 시작합니다. 가교 결합 된 염색질은 제한 효소로 소화되지만 MNase 소화도사용되었습니다 8,9. 소화 후, 공간적으로 가까운 유리 DNA 말단이 다시 결찰되고 가교가 역전됩니다. 이 단계는 3C ‘라이브러리’ 또는 ‘템플릿’을 생성하는데, 이는 핵에 3D 근접한 서열이 동일한 DNA 단편에서 결찰될 가능성이 더 높은 하이브리드 단편의 혼합 풀입니다. 이러한 하이브리드 단편의 다운스트림 정량화를 통해 선형 게놈에서 수천 개의 염기쌍 떨어져 있지만 3D 공간에서 상호 작용할 수 있는 게놈 영역의 3D 형태를 추론할 수 있습니다.
3C 라이브러리를 특성화하기 위해 다양한 접근 방식이 개발되었으며, 결찰 단편의 하위 집합이 분석되고 다운스트림 정량화에 사용되는 기술이 서로 다릅니다. 원래의 3C 프로토콜은 두 관심 영역의 선택과 PCR10,11에 의한 ‘일대일’ 상호 작용 빈도의 정량화에 의존했습니다. 4C 접근법(원형 염색체 형태 캡처)은 단일 관심 유전자좌(즉, ‘관점’)와 나머지 게놈(‘하나 대 모두’) 간의 상호 작용을 측정합니다12,13,14. 도 4C에서, 3C 라이브러리는 제2 분해 및 재결찰을 거쳐 관점 특이적 프라이머(15)에 의해 PCR 증폭되는 작은 원형 DNA 분자를 생성한다. 5C(염색체 형태 캡처 카본 카피)는 더 큰 관심 영역에서 3D 상호 작용의 특성화를 가능하게 하여 해당 영역 내에서 고차 염색질 접힘에 대한 통찰력을 제공합니다(‘다수 대 다수’)16. 도 5C에서, 3C 라이브러리는 유니버셜 프라이머(15)를 갖는 멀티플렉스 PCR에 의해 후속적으로 증폭될 수 있는 제한 부위를 중첩하는 올리고뉴클레오티드의 풀에 혼성화된다. 4C 및 5C 모두에서, 유익한 DNA 단편은 초기에 마이크로어레이에 의해 정량화되었고, 나중에는 차세대 시퀀싱(NGS)에 의해 정량화되었다17,18,19. 이러한 전략은 표적 관심 영역을 특성화하지만 게놈 전체의 상호 작용을 매핑하는 데는 적용할 수 없습니다. 이 후자의 목표는 3C 템플릿의 대규모 병렬 시퀀싱을 통해 게놈 전체 수준(‘모두 대 모두’)에서 염색질 접힘의 편향 없는 특성화를 허용하는 3C 기반 고처리량 전략인 Hi-C를 통해 달성됩니다(‘모두 대 모두’)20. Hi-C 프로토콜은 소화된 절편의 말단에 비오티닐화된 잔기를 혼입시킨 다음, 결찰된 절편의 회수율을 증가시키기 위해 스트렙타비딘 비드로 결찰 절편을 풀다운하는 것을 포함한다20.
Hi-C는 포유류 게놈이 3D 핵에서 여러 규모로 구조적으로 구성되어 있음을 밝혔습니다. 메가 베이스 규모에서 게놈은 활성 및 비활성 염색질 영역, A 및 B 구획으로 각각20,21로 나뉩니다. 상이한 염색질 및 활동 상태로 대표되는 추가 서브 구획의 존재도 이후에 나타났다22. 더 높은 분해능에서, 게놈은 위상 연관 도메인 (TADs)이라고 불리는 서브 메가 베이스 자기 상호 작용 도메인으로 더 분할되며, 인간 및 마우스 게놈23,24의 Hi-C 및 5C 분석에 의해 처음 밝혀졌습니다. 조직별 방식으로 변하는 구획과 달리 TAD는 일정한 경향이 있습니다(많은 예외가 있음에도 불구하고). 중요한 것은 TAD 경계가 종25에 걸쳐 보존된다는 것입니다. 포유류 세포에서 TAD는 종종 동일한 조절 환경을 공유하는 유전자를 포함하며 인접한 조절 영역과의 상호 작용을 제한하면서 유전자 공동 조절을 용이하게 하는 구조적 프레임워크를 나타내는 것으로 나타났습니다(검토 3,26,27,28). 또한, TAD 내에서, 응집력-압출 루프의 기저부에 있는 CTCF 부위로 인한 상호작용은 프로모터-인핸서 또는 인핸서-인핸서 상호작용의 확률을 증가시킬 수 있다(검토29).
Hi-C에서는 1Mb에서 40kb 해상도로 구획 및 TAD를 감지할 수 있지만 5-10kb 규모에서 원위 요소 간의 루프 상호 작용과 같은 더 작은 규모의 접점을 특성화하기 위해 더 높은 분해능을 달성할 수 있습니다. 그러나, HiC에 의해 이러한 루프를 효율적으로 검출할 수 있도록 분해능을 증가시키려면, 시퀀싱 깊이의 상당한 증가를 필요로 하고, 따라서 시퀀싱 비용도 증가시킨다. 분석이 대립 유전자 특이적이어야 하는 경우 이는 악화됩니다. 실제로, 분해능의 X-배 증가는 염기서열 분석 깊이의X2 증가를 필요로 하며, 이는 고분해능 및 대립유전자 특이적 게놈 전체 접근법이 엄청나게 비쌀 수 있음을 의미합니다30.
고분해능을 유지하면서 비용 효율성과 경제성을 개선하기 위해 다운스트림 염기서열 분석 전에 상보적인 비오틴 표지 올리고뉴클레오티드 프로브와 하이브리드화한 후 게놈 전체의 3C 또는 Hi-C 라이브러리에서 표적 관심 영역을 물리적으로 추출할 수 있습니다. 이러한 표적 농축 전략은 Capture-C 방법이라고 하며 게놈 전체에 흩어져 있는 수백 개의 표적 유전자좌(즉, Promoter Capture(PC) Hi-C; 차세대(NG) Capture-C; 낮은 입력(LI) 캡처-C; 핵 적정(NuTi) Capture-C; Tri-C)31,32,33,34,35,36,37,38,39,40 또는 최대 여러 메가베이스에 걸쳐 있는 지역(예: Capture HiC; HYbrid 캡처 Hi-C (Hi-C2); 타일-C)41,42,43. 2가지 측면은 포획 기반 방법에서 다양할 수 있다: (1) 비오티닐화 올리고뉴클레오티드의 성질 및 설계 (즉, RNA 또는 DNA, 분산된 게놈 표적을 포획하는 단일 올리고 또는 관심 영역을 타일링하는 다중 올리고); 및 (2) 3C 또는 Hi-C 라이브러리가 될 수 있는 타겟을 풀다운하는 데 사용되는 템플릿이며, 후자는 3C 라이브러리에서 풀다운된 비오티닐화된 제한 단편으로 구성됩니다.
여기서는 3C 라이브러리에서 타겟 접점의 강화를 기반으로 하는 Capture Hi-C 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 비오티닐화 RNA 프로브의 맞춤형 타일링 어레이 설계에 의존하며 3C 라이브러리 준비에서 NGS 시퀀싱까지 1주일 이내에 수행할 수 있습니다. 이 프로토콜은 빠르고 간단하며 5kb 해상도에서 메가베이스 크기의 관심 영역의 고차 3D 구성을 특성화하는 동시에 다른 3C 방법에 비해 시간 효율성과 경제성을 향상시킬 수 있습니다. Capture Hi-C 프로토콜은 X-염색체 불활성화(XCI)의 마스터 조절 유전자좌인 Xist 비암호화 RNA를 호스트하는 X-불활성화 센터(Xic)에 적용되었습니다. Xic은 이전에 광범위한 구조 및 기능 분석의 대상이었습니다 (검토44,45). 포유류에서 XCI는 암컷(XX)과 수컷(XY) 사이의 X-연관 유전자의 투여량을 보상하고 암컷 세포에서 두 개의 X 염색체 중 하나의 거의 전부의 전사 침묵을 포함합니다. Xic은 3D 게놈 토폴로지 및 유전자 조절44와의 상호 작용에 대한 연구를 위한 강력한 황금 표준 궤적을 나타냅니다. 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서 Xic에 대한 5C 분석은 TAD의 발견 및 명명으로 이어졌으며, 토폴로지 분할 및 유전자 공동 조절의 기능적 관련성에 대한 첫 번째 통찰력을 제공했습니다24. Xic의 토폴로지 조직은 이후 Xist 상향 조절 및 XCI 46의 적절한 발달 시기에 결정적으로 관여하는 것으로 나타났으며, TAD 내부 및 TAD 사이의 유전자 활성에 영향을 미칠 수 있는 의심되지 않는 시스 조절 요소도 최근 Xic47,48,49 내에서 발견되었습니다. Xic에 걸쳐 있는 마우스 X 염색체의 3Mb에 Capture Hi-C를 적용하면 고분해능에서 대규모 염색질 접힘을 해부하는 이 접근 방식의 힘을 알 수 있습니다. 관심 영역 내의 모든 DpnII 제한 부위에 걸친 비오티닐화 프로브 어레이의 설계부터 게놈 차원의 3C 라이브러리 생성, 표적 접촉의 혼성화 및 캡처, 다운스트림 데이터 분석에 이르기까지 상세하고 따르기 쉬운 프로토콜이 제공됩니다. 적절한 품질 관리 및 예상 결과에 대한 개요도 포함되어 있으며 접근 방식의 강점과 한계는 유사한 기존 방법에 비추어 논의됩니다.
여기에서는 5-10kb 해상도에서 메가베이스 크기 게놈 영역의 고차 조직을 특성화하기 위한 비교적 빠르고 쉬운 Capture Hi-C 프로토콜을 설명합니다. Capture Hi-C는 게놈 전체 3C 또는 Hi-C 템플릿에서 표적 염색질 상호작용을 강화하도록 설계된 Capture-C 기술 제품군에 속합니다. 현재까지 대부분의 Capture-C 애플리케이션은 전체 게놈에 흩어져 있는 비교적 작은 조절 요소의 염색질 접촉을 매핑하는 데 활용되었습니다. 첫 번째 Capture-C 프로토콜에서, 다수의 중첩 RNA 비오티닐화 프로브를 사용하여 적혈구 세포로부터 제조된 3C 라이브러리에서 >400개의 미리 선택된 프로모터를 포획하였다31. 이후 NG(Next Generation) 및 NuTi(Nuclear Titrated) Capture-C에서도 동일한 전략이 개선되어 단일 제한 부위에 걸친 단일 120bp DNA 미끼와 2회의 순차적 포획을 사용하여 >8,000 프로모터의 고분해능 상호작용 프로파일을 달성하여 유익한 결찰 단편의 농축을 극대화했습니다32,40. 이러한 전략은 마우스 배아 발달, 세포 분화, X-염색체 불활성화 및 병리학적 상태에서의 유전자 오조절을 포함하여 다양한 맥락에서 시스 작용 요소의 기능적 해부로 이어졌습니다46,63,65,66,67,68,69,70,71.
프로모터 포획 Hi-C (PCHi-C)에서, 제한 단편을 함유하는 >22,000 주석 달린 프로모터는 제한 단편34,72의 한쪽 또는 양쪽 말단에서 단일 RNA 120-mer 비오티닐화 프로브의 혼성화에 의해 Hi-C 라이브러리로부터 풀다운되었다. 이 방법은 마우스 배아 줄기 세포, 태아 간 세포 및 지방 세포 34,35,72,73뿐만 아니라 인간 림프구 계통, 조혈 전구 세포, 표피 각질 세포 및 만능 세포 37,74,75,76,77.
이러한 표적 농축 기술과 비교하여 Capture Hi-C는 최대 메가베이스 규모까지 인접한 게놈 영역을 표적으로 하여 하나 이상의 TAD에 걸쳐 유전자의 조절 환경을 포괄합니다. 전체 관심 영역은 표적 내의 각 DpnII 제한 부위를 포함하는 비오티닐화 프로브 어레이로 바둑판식으로 배열되어야 합니다. 3C 템플릿에 대한 비오티닐화 어레이의 하이브리드화, 후속 스트렙타비딘 기반 포획 및 다중화 시퀀싱을 위한 처리는 Illumina Paired-End 다중화 시퀀싱을 위한 표적 농축 시스템을 사용하여 수행됩니다. 전체 프로토콜은 3C 라이브러리 준비에서 NGS 시퀀싱에 이르기까지 1주일 만에 수행할 수 있으며 약간의 조정 및/또는 맞춤형 문제 해결만 필요하기 때문에 빠릅니다.
이 프로토콜은 또한 다른 3C 기반 방법과 비교하여 이점을 제공합니다. 5-10kb의 해상도에서 상호 작용 맵을 얻기 위해 100-120M paired-end 읽기를 시퀀싱했습니다. 비교를 위해 여기서는 20kb 해상도64 (GSM2053973)에 도달하기 위해 571M 읽기의 Hi-C 데이터 세트를 사용했으며 염색체 전체 Hi-C22로 5kb 해상도에 도달하려면 최소 10억 개의 읽기가 필요합니다.
본 연구에서 사용된 포획 Hi-C는 6-bp 절단기 제한효소47 에 기초하여 이전에 발표된 5C보다 훨씬 더 높은 분해능에 도달한다(보충표 1). 중요하게도, 5C에서 표적 상호 작용을 풍부하게하고 증폭하도록 설계된 전략은 염색질 상호 작용의 대립 유전자 특이 적 분석을 허용하지 않습니다. 반대로, Capture Hi-C 데이터는 대립유전자-특이적으로 맵핑될 수 있어서, 예를 들어 인간 세포 또는 유전적으로 상이한 마우스 균주를 교배함으로써 유도된 F1 하이브리드 세포주에서 상동성 염색체 쌍의 3D 구조적 풍경을 해부할 수 있다78. 5kb 해상도에서 대립 유전자 특이적 Capture Hi-C 상호 작용 맵을 생성하기 위해 SNP 적용 범위를 늘리기 위해 150bp paired-end read를 시퀀싱했습니다. 유사한 대립유전자-특이적 접근법이 인간 세포주에 적용될 수 있으며, 이에 대해 SNP의 주석이 이용 가능하다22.
중요한 것은 Capture Hi-C가 일반적으로 염기서열 분석 비용의 경제성을 향상시키면서 고분해능을 보장하지만, 맞춤형 비오티닐화 올리고뉴클레오티드의 생산이 이 방법의 전체 비용에 영향을 미친다는 것입니다. 따라서 가장 적합한 3C 분석법의 선택은 응용 분야마다 다르며, 다루고 있는 생물학적 문제와 필요한 분해능, 관심 영역의 크기에 따라 달라집니다. 개발된 다른 Capture Hi-C 프로토콜은 여기에 설명된 프로토콜과 주요 기능을 공유합니다. 예를 들어, 유방암 및 결장직장암 위험과 관련된 비암호화 변이체에 걸쳐 ~50kb에서 1Mb 게놈 영역을 특성화하기 위해 Capture Hi-C 전략이 적용되었습니다. 이 프로토콜에서, 표적 영역은 3배 커버리지33,38,79에서 표적 영역을 타일링하는 120-mer RNA 미끼를 혼성화함으로써 Hi-C 라이브러리로부터 풀다운되었습니다. 유사하게, HYbrid 캡처 Hi-C (Hi-C 2)는 최대2 Mb80의 관심 영역 내에서 상호 작용을 타겟팅하는 데 사용되었습니다. 두 프로토콜 모두에서 비오틴 풀다운 결찰 단편에 대해 강화된 Hi-C 템플릿을 사용하면 프로토콜에 비해 총 정보 판독 비율이 증가했습니다. 예를 들어, 비교64(GSM2053973)를 위해 여기에서 사용한 Hi-C 데이터 세트에서 중복 제거 후 유효한 쌍의 백분율은 그림 3 및 보충 표 1에 설명된 대로 Capture Hi-C에서 얻은 유효한 쌍보다 4.8배 더 높습니다. 그러나 비오티닐화 결찰 단편 및 하이브리드화된 프로브의 연속적인 풀다운은 프로토콜을 훨씬 더 복잡하고 시간 소모적으로 만드는 동시에 포획된 영역의 복잡성을 감소시킬 수 있습니다.
타일링 프로브로 3C 템플릿을 풍부하게 하는 또 다른 방법은 Tiled-C로, 마우스 적혈구 분화 동안 높은 공간 및 시간 분해능에서 염색질 구조를 연구하는 데 적용되었습니다43. Tiled-C에서, 70 bp 비오티닐화 프로브의 패널은 표적 상호작용43,81의 매우 높은 해상도 맵을 생성하기 위해 2개의 연속 포획 라운드에서 대규모 영역 내의 접촉을 풍부하게 하는 데 사용된다. 또한 이중 캡처 강화는 Capture Hi-C와 비교할 때 프로토콜을 더 길고 복잡하게 만듭니다. 그러나, 단일 제한 부위를 표적으로 하는 Capture-C 전략과는 달리, Tiled-C에서 2차 포획은 포획 효율을 유의하게 증가시키지 않는 것으로 보이므로, 아마도 생략될 수 있다(43). 마지막으로, 이 연구에서 사용된 것과 동일한 표적 농축 전략을 기반으로 하는 유사한 타일링 접근 방식이 선천성 기형 환자에서 설명되고 형질전환 마우스에서 재설계된 구조적 변이를 포함하는 규제 환경의 해부에 적용되었습니다41,42. 이 경우, 프로브의 타일링 어레이는 DpnII 제한 부위(41)의 근접보다는 전체 표적에 걸쳐 설계되었다. 그럼에도 불구하고, 이 연구는 다양한 맥락에서 큰 게놈 영역의 고해상도 특성화를 달성하기 위한 이 전략의 민감도와 힘을 강조하는 데 중요했습니다(41,42,48).
결론적으로, 여기에 설명된 프로토콜은 관심 있는 모든 게놈 영역의 고해상도 3D 특성화를 위한 쉽고 강력하며 강력한 전략을 나타냅니다. 다양한 모델 시스템, 세포 유형, 발달 조절 염색질 풍경 및 건강하고 병리학적인 조건에서 유전자 조절에 이 접근 방식을 적용하면 후성 유전학 분야의 근본적인 미해결 질문 중 하나인 게놈 토폴로지와 유전자 조절 사이의 상호 작용 및 인과 관계에 대한 이해를 촉진할 수 있습니다. 또한, Capture Hi-C를 적용하여 GWAS 연구에 의해 확인된 위험 변이체의 장거리 상호 작용 및 고차 염색질 접힘을 매핑하면 다양한 맥락에서 인간 질병과 관련된 비암호화 게놈 유전자좌의 기능적 관련성을 밝힐 수 있는 잠재력이 있으며, 이를 통해 잠재적으로 발병의 기저에 있는 과정에 대한 새로운 통찰력을 제공할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
허드 실험실에서의 작업은 유럽 연구위원회 (European Research Council) 고급 조사자 상 (XPRESS-AdG671027)의 지원을 받았습니다. AL은 유럽 연합 Marie Skłodowska-Curie Actions Individual Fellowship(IF-838408)의 지원을 받습니다. AH는 Marie Skłodowska-Curie Grant 계약 813327에 따라 ITN 혁신 및 학제 간 네트워크 ChromDesign의 지원을 받습니다. 저자는 유용한 기술 자문을 제공한 Daniel Ibrahim(MPI for Molecular Genetics, Berlin), Institut Curie(파리)의 NGS 플랫폼, 지원과 지원을 제공한 EMBL(Heidelberg)의 Vladimir Benes 및 Genomics Core Facility에 감사드립니다.
10x PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
37% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15686 | single use glass-vials; do not reuse |
50 mL PP conical tube | Falcon | 352070 | |
Agarose | Sigma | A9539-500g | |
Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
Cell Scrapers – 25 cm Handle and 3.0 cm Blade | Falcon | 353089 | |
CHIR99021 | Axon Medchem BV | Axon 1386 | |
cOmplete Mini, Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Merck | 11836170001 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
Countess II FL | Invitrogen | ZGEXSCCOUNTESS2FL | Automated cell counter |
Covaris S2 | Covaris | 500217 | Sonicator |
DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
DpnII (50000 units/mL) | New England Biolabs | R0543M | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Merck | D6429 | |
Ethanol (100%) | Merck | 1.00983.2500 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10270106 | |
gelatine from porcine skin | Sigma | G1890 | |
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
GlycoBlue | Thermo Scientific | AM9516 | Coprecipitant |
High-Sensitivity Bioanlayzer chips | Agilent | 5067-4626 | |
Large Cooling Centrifuge 5920 R | Eppendorf | 5948000018 | |
leukaemia inhibitory factor (LIF) | Merck | ESG1107 | |
Liquiport | KNF | NF300 | Benchtop aspiration system |
Low-binding filter tips | Biozym | VT0260U, VT0240, VT0220, VT0200U | |
Molecular biology grade water | Merck | W3500-6x500ML | |
Next Seq 500 | Illumina | SY-415-1001 | |
Next Seq 500 High Output v2 Kit (300 cycles) | Illumina | FC-404-2004 | |
Nonidet P40 Substitute (NP40) | Merck | 11332473001 | |
PD0325901 | Axon Medchem BV | Axon 1408 | |
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Merck | 11873580001 | |
Proteinase K – recombinant, PCR-grade (20 mg/mL) | Thermo Scientific | EO0491 | |
Qubit 2.0 | Thermo Scientific | Q32871 | |
Qubit assay tubes | Thermo Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA High Sensitivity kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
RNase A (10 mg/mL) | Thermo Scientific | EN0531 | |
Sodium acetate pH 5.2 (3M) | Merck | S7899 | |
speed vacuum concentrator | Eppendorf | EP5305000100-1EA | |
Agencourt AMPureXP | Beckman Coulter | A63881 | SPRI beads |
SureSelect Target Enrichment Box 1 | Agilent | 5190-8645 | |
SureSelect Target Enrichment Kit ILM Indexing Hyb Module Box 2 | Agilent | 5190-4455 | |
SureSelect XT Library Prep Kit ILM | Agilent | 5500-0132 | |
T4 ligase (30 units/µL) | Thermo Scientific | EL0013 | |
table-top Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000012 | |
Triton-X-100 (500 mL) | Merck | X100-500ML | |
Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
Trypsine | Thermo Scientific | 25300054 | |
UltraPure Glycine | Thermo Scientific | 15527013 | |
β-mercaptoethanol | Thermo Scientific | 31350010 |