Dit protocol beschrijft de Capture Hi-C-methode die wordt gebruikt om de 3D-organisatie van megagebaseerde gerichte genomische regio’s met hoge resolutie te karakteriseren, inclusief grenzen van topologisch associërende domeinen (TAD’s) en chromatine-interacties op lange afstand tussen regulerende en andere DNA-sequentie-elementen.
De ruimtelijke organisatie van het genoom draagt bij aan de functie en regulatie ervan in vele contexten, waaronder transcriptie, replicatie, recombinatie en reparatie. Het begrijpen van de exacte causaliteit tussen genoomtopologie en -functie is daarom cruciaal en in toenemende mate het onderwerp van intensief onderzoek. Chromosoomconformatie-opnametechnologieën (3C) maken het mogelijk om de 3D-structuur van chromatine af te leiden door de frequentie van interacties tussen elk gebied van het genoom te meten. Hier beschrijven we een snel en eenvoudig protocol om Capture Hi-C uit te voeren, een op 3C gebaseerde doelverrijkingsmethode die de allelspecifieke 3D-organisatie van megagebaseerde genomische doelen met hoge resolutie karakteriseert. In Capture Hi-C worden doelgebieden opgevangen door een reeks gebiotinyleerde sondes voordat downstream high-throughput sequencing plaatsvindt. Zo worden een hogere resolutie en allel-specificiteit bereikt terwijl de tijdseffectiviteit en betaalbaarheid van de technologie worden verbeterd. Om zijn sterke punten aan te tonen, werd het Capture Hi-C-protocol toegepast op het X-inactivatiecentrum van de muis (Xic), de hoofdregulerende locus van X-chromosoominactivatie (XCI).
Het lineaire genoom bevat alle informatie die nodig is voor een organisme om een embryonale ontwikkeling te ondergaan en te overleven gedurende de volwassenheid. Het instrueren van genetisch identieke cellen om verschillende functies uit te voeren is echter van fundamenteel belang om nauwkeurig te controleren welke informatie wordt gebruikt in specifieke contexten, inclusief verschillende weefsels en / of ontwikkelingsstadia. De driedimensionale organisatie van het genoom wordt verondersteld deel te nemen aan deze nauwkeurige spatio-temporele regulatie van genactiviteit door de fysieke interactie tussen regulerende elementen die kunnen worden gescheiden door enkele honderden kilobases in het lineaire genoom te vergemakkelijken of te voorkomen (voor beoordelingen 1,2,3). In de afgelopen 20 jaar is ons begrip van de wisselwerking tussen genoomvouwing en activiteit snel toegenomen, grotendeels als gevolg van de ontwikkeling van chromosoomconformatievangsttechnologieën (3C) (voor overzicht 4,5,6,7). Deze methoden meten de frequentie van interacties tussen alle regio’s van het genoom en vertrouwen op de ligatie van DNA-sequenties die zich in nauwe 3D-nabijheid binnen de kern bevinden. De meest voorkomende 3C-protocollen beginnen met de fixatie van celpopulaties met een cross-linking middel zoals formaldehyde. Het verknoopte chromatine wordt vervolgens verteerd met een restrictie-enzym, hoewel MNase-vertering ook is gebruikt 8,9. Na de spijsvertering worden vrije DNA-uiteinden in nauwe ruimtelijke nabijheid opnieuw geligeerd en wordt cross-linking omgekeerd. Deze stap geeft aanleiding tot de 3C ‘bibliotheek’ of ‘template’, een gemengde pool van hybride fragmenten waarin sequenties die zich in 3D in de nabijheid van de kern bevonden een grotere kans hebben om geligeerd te worden in hetzelfde DNA-fragment. De stroomafwaartse kwantificering van deze hybride fragmenten maakt het mogelijk om de 3D-conformatie af te leiden van genomische gebieden die zich duizenden basenparen uit elkaar bevinden in het lineaire genoom, maar mogelijk interageren in de 3D-ruimte.
Er zijn veel verschillende benaderingen ontwikkeld om de 3C-bibliotheek te karakteriseren, die zowel verschillen in termen van welke subsets van ligatiefragmenten worden geanalyseerd als welke technologie wordt gebruikt voor hun downstream-kwantificering. Het oorspronkelijke 3C-protocol was gebaseerd op de selectie van twee interessante regio’s en de kwantificering van hun ‘één versus één’ interactiefrequentie met PCR10,11. De 4C-benadering (circular chromosome conformation capture) meet de interacties tussen een enkele locus of interest (d.w.z. het ‘view-point’) en de rest van het genoom (‘one versus all’)12,13,14. In 4C ondergaat de 3C-bibliotheek een tweede ronde van vertering en herligatie om kleine circulaire DNA-moleculen te genereren die PCR worden versterkt door view-point specifieke primers15. 5C (chromosome conformation capture carbon copy) maakt de karakterisering van 3D-interacties over grotere interessegebieden mogelijk, wat inzicht geeft in chromatinevouwing van hogere orde binnen dat gebied (‘veel versus veel’)16. In 5C wordt de 3C-bibliotheek gehybridiseerd tot een pool van oligonucleotiden die overlappende restrictieplaatsen die vervolgens kunnen worden versterkt door multiplex PCR met universele primers15. In zowel 4C als 5C werden de informatieve DNA-fragmenten aanvankelijk gekwantificeerd door microarrays en later door next-generation sequencing (NGS)17,18,19. Deze strategieën karakteriseren gerichte regio’s van belang, maar kunnen niet worden toegepast om genoombrede interacties in kaart te brengen. Dit laatste doel wordt bereikt met Hi-C, een op 3C gebaseerde high-throughput strategie waarbij massaal parallelle sequencing van de 3C-template de onbevooroordeelde karakterisering van chromatinevouwing op genoombreed niveau (‘alles versus alle’)20 mogelijk maakt. Het Hi-C-protocol omvat de opname van een gebiotinyleerd residu aan de uiteinden van de verteerde fragmenten, gevolgd door het naar beneden trekken van ligatiefragmenten met streptavidineparels om het herstel van geligeerde fragmenten te vergroten20.
Hi-C onthulde dat het genoom van zoogdieren structureel georganiseerd is op meerdere schalen in de 3D-kern. Op de megabaseschaal is het genoom verdeeld in gebieden van actief en inactief chromatine, de A- en B-compartimenten, respectievelijk20,21. Het bestaan van verdere subcompartimenten vertegenwoordigd door verschillende chromatine- en activiteitstoestanden werd vervolgens ook aangetoond22. Bij een hogere resolutie wordt het genoom verder verdeeld in sub-megabase zelf-interagerende domeinen genaamd topologisch associërende domeinen (TAD’s), voor het eerst onthuld door Hi-C en 5C analyse van de menselijke en muis genomen23,24. In tegenstelling tot compartimenten die op een weefselspecifieke manier variëren, zijn TAD’s meestal constant (hoewel er veel uitzonderingen zijn). Belangrijk is dat TAD-grenzen behouden blijven voor soort25. In zoogdiercellen omvatten TAD’s vaak genen die hetzelfde regulerende landschap delen en is aangetoond dat ze een structureel kader vertegenwoordigen dat genco-regulatie vergemakkelijkt en tegelijkertijd de interacties met naburige regulerende domeinen beperkt (voor beoordeling 3,26,27,28). Bovendien kunnen interacties als gevolg van CTCF-locaties aan de basis van cohesine-geëxtrudeerde lussen binnen TAD’s de kans op interacties tussen promotor-enhancer of enhancer-enhancer vergroten (voor review29).
In Hi-C kunnen compartimenten en TAD’s worden gedetecteerd met een resolutie van 1 Mb tot 40 kb, maar een hogere resolutie kan worden bereikt om contacten op kleinere schaal te karakteriseren, zoals looping-interacties tussen distale elementen op een schaal van 5-10 kb. Het verhogen van de resolutie om dergelijke lussen efficiënt door HiC te kunnen detecteren, vereist echter een aanzienlijke toename van de sequencingdiepte en dus sequencingkosten. Dit wordt verergerd als de analyse allelspecifiek moet zijn. Inderdaad, een X-voudige toename in resolutie vereist een X2-toename in sequencingdiepte, wat betekent dat benaderingen met hoge resolutie en allelspecifieke genoombrede benaderingen onbetaalbaar kunnen zijn30.
Om de kosteneffectiviteit en betaalbaarheid te verbeteren met behoud van een hoge resolutie, kunnen doelgebieden van belang fysiek worden verwijderd uit genoombrede 3C- of Hi-C-bibliotheken na hun hybridisatie met complementaire biotine-gelabelde oligonucleotide-sondes voordat downstream sequencing. Deze doelverrijkingsstrategieën worden Capture-C-methoden genoemd en maken het mogelijk om interacties van honderden doelloci verspreid over het genoom te ondervragen (d.w.z. Promoter Capture (PC) Hi-C; Volgende generatie (NG) Capture-C; Low Input (LI) Capture-C; Nucleair getitreerde (NuTi) Capture-C; Tri-C)31,32,33,34,35,36,37,38,39,40, of over regio’s die zich uitstrekken tot verschillende megabases (d.w.z. Capture HiC; HYbrid Capture Hi-C (Hi-C2); Betegeld-C)41,42,43. Twee aspecten kunnen variëren in op vangst gebaseerde methoden: (1) de aard en het ontwerp van gebiotinyleerde oligonucleotiden (d.w.z. RNA of DNA, enkele oligo’s die verspreide genomische doelen vastleggen of meerdere oligo’s die een interessant gebied betegelen); en (2) de sjabloon die wordt gebruikt voor het neerhalen van doelen die de 3C- of Hi-C-bibliotheek kunnen zijn, de laatste bestaande uit gebiotinyleerde restrictiefragmenten die uit de 3C-bibliotheek zijn getrokken.
Hier wordt een Capture Hi-C-protocol beschreven op basis van de verrijking van doelcontacten uit de 3C-bibliotheek. Het protocol is gebaseerd op het ontwerp van een op maat gemaakte tegelreeks van gebiotinyleerde RNA-sondes en kan in 1 week worden uitgevoerd van de voorbereiding van de 3C-bibliotheek tot de NGS-sequencing. Het protocol is snel, eenvoudig en maakt het mogelijk om de hogere orde 3D-organisatie van megabase-sized regio’s van belang te karakteriseren met een resolutie van 5 kb, terwijl de effectiviteit van de tijd en de betaalbaarheid worden verbeterd in vergelijking met andere 3C-methoden. Het Capture Hi-C-protocol werd toegepast op de master regulatory locus van X-chromosoominactivatie (XCI), het X-inactivatiecentrum (Xic), dat het Xist niet-coderende RNA host. De Xic is eerder het onderwerp geweest van uitgebreide structurele en functionele analyses (voor review44,45). Bij zoogdieren compenseert XCI de dosering van X-gebonden genen tussen vrouwtjes (XX) en mannetjes (XY) en omvat het transcriptionele uitschakeling van bijna het geheel van een van de twee X-chromosomen in vrouwelijke cellen. De Xic vertegenwoordigt een krachtige, gouden standaardlocus voor studies in 3D-genoomtopologie en de wisselwerking met genregulatie44. 5C-analyse van de Xic in embryonale stamcellen van muizen (mESCs) leidde tot de ontdekking en naamgeving van TAD’s, wat de eerste inzichten verschafte in de functionele relevantie van topologische partitionering en genco-regulatie24. De topologische organisatie van de Xic bleek vervolgens kritisch betrokken te zijn bij de juiste ontwikkelingstiming van Xist-upregulatie en XCI46, en onvermoede cis-regulerende elementen die de genactiviteit binnen en tussen TAD’s kunnen beïnvloeden, werden onlangs ook ontdekt binnen de Xic47,48,49. Het toepassen van Capture Hi-C op 3 Mb van het X-chromosoom van de muis dat de Xic overspant, toont de kracht van deze aanpak bij het ontleden van grootschalige chromatinevouwing met hoge resolutie. Een gedetailleerd en gemakkelijk te volgen protocol wordt geleverd, beginnend bij het ontwerp van de reeks gebiotinyleerde sondes op elke DpnII-beperkingslocatie binnen het gebied van belang tot het genereren van de genoombrede 3C-bibliotheek, de hybridisatie en vastlegging van doelcontacten en downstream data-analyse. Een overzicht van de juiste kwaliteitscontroles en verwachte resultaten is ook opgenomen, en zowel de sterke als de beperkingen van de aanpak worden besproken in het licht van vergelijkbare bestaande methoden.
Hier beschrijven we een relatief snel en eenvoudig Capture Hi-C-protocol om de hogere orde organisatie van genomische regio’s ter grootte van megabases te karakteriseren met een resolutie van 5-10 kb. Capture Hi-C behoort tot de familie van Capture-C-technologieën die zijn ontworpen om gerichte chromatine-interacties van genoombrede 3C- of Hi-C-sjablonen te verrijken. Tot op heden is de grote meerderheid van Capture-C-toepassingen gebruikt om chromatinecontacten van relatief kleine regulerende elementen verspreid over het hele genoom in kaart te brengen. In het eerste Capture-C-protocol werden meerdere overlappende RNA-biotinyleerde sondes gebruikt om >400 vooraf geselecteerde promotors vast te leggen in 3C-bibliotheken bereid uit erytroïde cellen31. Dezelfde strategie werd vervolgens verbeterd in Next Generation (NG) en Nuclear Titrated (NuTi) Capture-C om interactieprofielen met hoge resolutie van >8.000 promotors te bereiken door gebruik te maken van enkel 120 bp DNA-aas verspreid over enkele restrictielocaties en twee opeenvolgende rondes van Capture om de verrijking van informatieve ligatiefragmenten te maximaliseren32,40. Deze strategieën leidden tot de functionele dissectie van cis-werkende elementen in veel verschillende contexten, waaronder embryonale ontwikkeling van muizen, celdifferentiatie, X-chromosoominactivatie en genmisregulatie in pathologische omstandigheden 46,63,65,66,67,68,69,70,71.
In Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) werden >22.000 geannoteerde promotors met restrictiefragmenten uit Hi-C-bibliotheken gehaald door hybridisatie van enkele RNA 120-mer gebiotinyleerde sondes aan een of beide uiteinden van het restrictiefragment34,72. Deze methode maakte dissectie mogelijk van het interactoom van duizenden promotors in een snel toenemend aantal celtypen, waaronder embryonale stamcellen van muizen, foetale levercellen en adipocyten 34,35,72,73, maar ook menselijke lymfoblastoïde lijnen, hematopoietische voorlopercellen, epidermale keratinocyten en pluripotente cellen 37,74,75,76,77.
In vergelijking met deze doelverrijkingstechnologieën richt Capture Hi-C zich op aaneengesloten genomische regio’s tot op de megabaseschaal, waardoor een of meer TAD’s worden overspannen en regulerende landschappen van genen worden omvat. Het hele gebied van belang moet worden betegeld met een reeks gebiotinyleerde sondes die elke DpnII-beperkingslocatie binnen het doelwit omvatten. De hybridisatie van de gebiotinyleerde array naar de 3C-sjabloon, de daaropvolgende op streptavidin gebaseerde opname en verwerking voor multiplexed sequencing wordt uitgevoerd met behulp van een doelverrijkingssysteem voor Illumina Paired-End multiplexed sequencing. Het hele protocol is snel, omdat het in 1 week kan worden uitgevoerd, van 3C-bibliotheekvoorbereiding tot NGS-sequencing, en het vereist slechts kleine aanpassingen en / of aangepaste specifieke probleemoplossing.
Het protocol biedt ook voordelen in vergelijking met andere 3C-gebaseerde methoden. Om interactiekaarten met een resolutie van 5-10 kb te verkrijgen, hebben we 100-120 M paired-end reads gesequenced. Ter vergelijking gebruikten we hier een Hi-C-dataset van 571 M-reads om een resolutie van 20 kb64 (GSM2053973) te bereiken, en ten minste 1 miljard reads zouden nodig zijn om een resolutie van 5 kb te bereiken met chromosoombrede Hi-C22.
Capture Hi-C zoals gebruikt in deze studie bereikt een veel hogere resolutie dan de eerder gepubliceerde 5C op basis van een 6-bp cutterrestrictie-enzym47 (aanvullende tabel 1). Belangrijk is dat de strategie die is ontworpen om gerichte interacties in 5C te verrijken en te versterken, geen allelspecifieke analyse van chromatine-interacties mogelijk maakt. Integendeel, Capture Hi-C-gegevens kunnen allelspecifiek in kaart worden gebracht, waardoor de 3D-structurele landschappen van paren homologe chromosomen kunnen worden ontleed, bijvoorbeeld in menselijke cellen of in F1 hybride cellijnen afgeleid door genetisch verschillende muizenstammen te kruisen78. Om allel-specifieke Capture Hi-C-interactiekaarten met een resolutie van 5 kb te genereren, hebben we 150 bp paired-end reads gesequenced om de SNP-dekking te vergroten. Soortgelijke allelspecifieke benaderingen kunnen worden toegepast op menselijke cellijnen, waarvoor de annotatie van SNP’s beschikbaar is22.
Belangrijk is dat, hoewel Capture Hi-C over het algemeen een hoge resolutie garandeert en tegelijkertijd de betaalbaarheid van sequencingkosten verbetert, de productie van op maat gemaakte gebiotinyleerde oligonucleotiden een impact heeft op de totale kosten van deze methode. Daarom zal de keuze van de meest geschikte 3C-methode verschillen voor verschillende toepassingen en afhangen van de biologische vraag die wordt aangepakt en de vereiste resolutie, evenals de grootte van het interessegebied. Andere Capture Hi-C-protocollen die zijn ontwikkeld, delen belangrijke functies met het protocol dat hier wordt beschreven. Er werd bijvoorbeeld een Capture Hi-C-strategie toegepast om ~ 50 kb tot 1 Mb genomische regio’s te karakteriseren die niet-coderende varianten omvatten die verband houden met het risico op borst- en colorectale kanker; in dit protocol werden doelgebieden uit Hi-C-bibliotheken gehaald door 120-mer RNA-aas te hybridiseren en de doelgebieden te betegelen met een 3x dekkingvan 33,38,79. Op dezelfde manier werd HYbrid Capture Hi-C (Hi-C 2) gebruikt om interacties binnen interessante regio’s tot2 Mb80 te targeten. In beide protocollen verhoogde het gebruik van een Hi-C-sjabloon verrijkt voor biotine pull-down ligatiefragmenten het percentage totale informatieve lezingen in vergelijking met ons protocol. In de Hi-C-dataset die we hier hebben gebruikt voor vergelijking64 (GSM2053973), is het percentage geldige paren na het verwijderen van duplicaten bijvoorbeeld 4,8 keer hoger dan de geldige paren verkregen in Capture Hi-C zoals beschreven in figuur 3 pt aanvullende tabel 1. De opeenvolgende pull-down van gebiotinyleerde geligeerde fragmenten en gehybridiseerde sondes maakt het protocol echter aanzienlijk complexer en tijdrovender, terwijl de complexiteit van het gevangen gebied mogelijk wordt verminderd.
Een andere beschikbare methode om 3C-sjablonen te verrijken met tegelsondes is Tiled-C, dat werd toegepast om chromatine-architectuur te bestuderen met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie tijdens de erytroïde differentiatie van de muis43. In Tiled-C wordt een panel van 70 bp gebiotinyleerde sondes gebruikt om contacten binnen grootschalige regio’s te verrijken in twee opeenvolgende opnamerondes om kaarten met zeer hoge resolutie van gerichte interacties te genereren43,81. De dubbele opnameverrijking maakt het protocol ook langer en complexer in vergelijking met Capture Hi-C. In tegenstelling tot de Capture-C-strategieën die zich richten op afzonderlijke beperkingslocaties, lijkt de tweede opnameronde in Tiled-C de opname-efficiëntie echter niet significant te verhogen en kan daarom waarschijnlijk worden weggelaten43. Ten slotte werd een vergelijkbare tegelbenadering op basis van dezelfde doelverrijkingsstrategie die in deze studie werd gebruikt, toegepast op de dissectie van regulerende landschappen die structurele varianten omvatten die worden beschreven bij patiënten met aangeboren misvormingen en opnieuw worden ontworpen in transgene muizen41,42. In dit geval is de betegelingsarray van sondes ontworpen over het hele doel in plaats van in de nabijheid van DpnII-beperkingslocaties41. Niettemin was dit werk baanbrekend in het benadrukken van de gevoeligheid en kracht van deze strategie om een hoge resolutie karakterisering van grote genomische regio’s in verschillende contexten te bereiken41,42,48.
Kortom, het hier beschreven protocol vertegenwoordigt een eenvoudige, robuuste en krachtige strategie voor de 3D-karakterisering met hoge resolutie van alle genomische regio’s van belang. De toepassing van deze benadering op verschillende modelsystemen, celtypen, ontwikkelingsgereguleerde chromatinelandschappen en genregulatie in gezonde en pathologische omstandigheden zal waarschijnlijk ons begrip van de wisselwerking en causaliteit tussen genoomtopologie en genregulatie vergemakkelijken, een van de fundamentele open vragen op het gebied van epigenetica. Bovendien heeft het toepassen van Capture Hi-C om langeafstandsinteracties en hogere-orde chromatinevouwing van risicovarianten geïdentificeerd door GWAS-studies in kaart te brengen, het potentieel om de functionele relevantie van niet-coderende genomische loci geassocieerd met menselijke ziekten in verschillende contexten te onthullen, waardoor nieuwe inzichten worden verkregen in de processen die mogelijk ten grondslag liggen aan pathogenese.
The authors have nothing to disclose.
Het werk in het Heard-laboratorium werd ondersteund door een European Research Council Advanced Investigator award (XPRESS – AdG671027). A.L. wordt ondersteund door een Marie Skłodowska-Curie Actions Individual Fellowship van de Europese Unie (IF-838408). A.H. wordt ondersteund door het ITN Innovative and Interdisciplinary Network ChromDesign, onder de Marie Skłodowska-Curie Grant overeenkomst 813327. De auteurs zijn Daniel Ibrahim (MPI for Molecular Genetics, Berlijn) dankbaar voor nuttig technisch advies, het NGS-platform van het Institut Curie (Parijs) en Vladimir Benes en de Genomics Core Facility van EMBL (Heidelberg) voor ondersteuning en assistentie.
10x PBS pH 7.4 | Gibco | 10010-023 | |
37% (vol/vol) paraformaldehyde solution | Electron Microscopy Sciences | 15686 | single use glass-vials; do not reuse |
50 mL PP conical tube | Falcon | 352070 | |
Agarose | Sigma | A9539-500g | |
Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | |
Cell Scrapers – 25 cm Handle and 3.0 cm Blade | Falcon | 353089 | |
CHIR99021 | Axon Medchem BV | Axon 1386 | |
cOmplete Mini, Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Merck | 11836170001 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
Countess II FL | Invitrogen | ZGEXSCCOUNTESS2FL | Automated cell counter |
Covaris S2 | Covaris | 500217 | Sonicator |
DNA LoBind tube, 1.5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
DpnII (50000 units/mL) | New England Biolabs | R0543M | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Merck | D6429 | |
Ethanol (100%) | Merck | 1.00983.2500 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | 10270106 | |
gelatine from porcine skin | Sigma | G1890 | |
GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0313 | |
GlycoBlue | Thermo Scientific | AM9516 | Coprecipitant |
High-Sensitivity Bioanlayzer chips | Agilent | 5067-4626 | |
Large Cooling Centrifuge 5920 R | Eppendorf | 5948000018 | |
leukaemia inhibitory factor (LIF) | Merck | ESG1107 | |
Liquiport | KNF | NF300 | Benchtop aspiration system |
Low-binding filter tips | Biozym | VT0260U, VT0240, VT0220, VT0200U | |
Molecular biology grade water | Merck | W3500-6x500ML | |
Next Seq 500 | Illumina | SY-415-1001 | |
Next Seq 500 High Output v2 Kit (300 cycles) | Illumina | FC-404-2004 | |
Nonidet P40 Substitute (NP40) | Merck | 11332473001 | |
PD0325901 | Axon Medchem BV | Axon 1408 | |
Protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | Merck | 11873580001 | |
Proteinase K – recombinant, PCR-grade (20 mg/mL) | Thermo Scientific | EO0491 | |
Qubit 2.0 | Thermo Scientific | Q32871 | |
Qubit assay tubes | Thermo Scientific | Q32856 | |
Qubit dsDNA High Sensitivity kit | Thermo Scientific | Q32851 | |
RNase A (10 mg/mL) | Thermo Scientific | EN0531 | |
Sodium acetate pH 5.2 (3M) | Merck | S7899 | |
speed vacuum concentrator | Eppendorf | EP5305000100-1EA | |
Agencourt AMPureXP | Beckman Coulter | A63881 | SPRI beads |
SureSelect Target Enrichment Box 1 | Agilent | 5190-8645 | |
SureSelect Target Enrichment Kit ILM Indexing Hyb Module Box 2 | Agilent | 5190-4455 | |
SureSelect XT Library Prep Kit ILM | Agilent | 5500-0132 | |
T4 ligase (30 units/µL) | Thermo Scientific | EL0013 | |
table-top Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000012 | |
Triton-X-100 (500 mL) | Merck | X100-500ML | |
Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
Trypsine | Thermo Scientific | 25300054 | |
UltraPure Glycine | Thermo Scientific | 15527013 | |
β-mercaptoethanol | Thermo Scientific | 31350010 |