In Ovo und Ex Ovo Methoden zur Untersuchung der Entwicklung des Vogelinnenohrs
Summary
Das Küken ist ein kostengünstiger, zugänglicher und weit verbreiteter Modellorganismus für eine Vielzahl von Studien. Hier wird eine Reihe von Protokollen detailliert beschrieben, um die molekularen Mechanismen zu verstehen, die der Entwicklung und Regeneration des Vogelinnenohrs zugrunde liegen.
Abstract
Das Innenohr nimmt Geräusche wahr und hält das Gleichgewicht über die Cochlea und den Vorraum aufrecht. Dies geschieht durch die Verwendung eines dedizierten mechanosensorischen Zelltyps, der als Haarzelle bekannt ist. Die Grundlagenforschung im Innenohr hat zu einem tiefen Verständnis geführt, wie die Haarzellen funktionieren und wie Dysregulation zu Hörverlust und Schwindel führen kann. Für diese Forschung war die Maus das herausragende Modellsystem. Mäuse haben jedoch, wie alle Säugetiere, die Fähigkeit verloren, Haarzellen zu ersetzen. Wenn man also versucht, zelluläre Therapien zur Wiederherstellung der Innenohrfunktion zu verstehen, könnten ergänzende Studien an anderen Wirbeltierarten weitere Erkenntnisse liefern. Das auditorische Epithel von Vögeln, die Basilarpapille (BP), ist eine Epithelschicht, die aus mechanosensorischen Haarzellen (HCs) besteht, die von Stützzellen (SCs) interkaliert werden. Obwohl sich die anatomische Architektur der Basilarpapille und der Säugetier-Cochlea unterscheidet, sind die molekularen Mechanismen der Innenohrentwicklung und des Hörens ähnlich. Dies macht die Basilarpapille zu einem nützlichen System nicht nur für vergleichende Studien, sondern auch für das Verständnis der Regeneration. Hier beschreiben wir Sezier- und Manipulationstechniken für das Hühnerinnenohr. Die Technik zeigt genetische und niedermolekulare Hemmungsmethoden, die ein potentes Werkzeug zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der Innenohrentwicklung bieten. In diesem Artikel diskutieren wir de Ovo-Elektroporationstechniken, um die Basilarpapille unter Verwendung von CRIPSR-Cas9-Deletionen genetisch zu stören, gefolgt von der Dissektion der Basilarpapille. Wir demonstrieren auch die BP-Organkultur und die optimale Verwendung von Kulturmatrices, um die Entwicklung des Epithels und der Haarzellen zu beobachten.
Introduction
Das Innenohr aller Wirbeltiere leitet sich von einem einfachen Epithel ab, das als otische Placode 1,2 bekannt ist. Dadurch entstehen alle strukturellen Elemente und Zelltypen, die notwendig sind, um die mechanosensorischen Informationen zu übertragen, die mit dem Hören und der Gleichgewichtswahrnehmung verbunden sind. Haarzellen (HCs), der Flimmersensor des Innenohrs, sind von Stützzellen (SCs) umgeben. HCs leiten Informationen über die Neuronen des achten Hirnnervs an das auditorische Hinterhirn weiter. Diese werden ebenfalls aus dem otischen Placode3 generiert. Die primäre Schalltransduktion wird an der apikalen Oberfläche des auditorischen HC durch ein mechanisch empfindliches Haarbündel4 erreicht. Dies wird durch modifizierte Aktin-basierte Vorsprünge, sogenannte Stereozilien, vermittelt, die in einem abgestuften Treppenmusterangeordnet sind 5. Darüber hinaus organisiert ein modifiziertes primäres Zilium, das sogenannte Kinocilium, die Haarbündelbildung und grenzt an die höchste Reihe von Stereozilien 6,7,8. Die Architektur der Stereozilien ist entscheidend für diese Rolle bei der Umwandlung mechanischer Reize, die von akustischer Energie in elektrische neuronale Signale abgeleitet werden9. Eine Schädigung des auditiven HC durch Alterung, Infektion, otoakustisches Trauma oder ototoxischer Schock kann zu einem teilweisen oder vollständigen Hörverlust führen, der bei Säugetieren irreversibel ist10.
Es wurden zelluläre Ersatztherapien vorgeschlagen, die solche Schäden reparieren könnten11,12. Der Ansatz dieser Forschung bestand darin, die normale Entwicklung der Haarzelle von Säugetieren zu verstehen und zu fragen, ob Entwicklungsprogramme in vorläuferähnlichen Zellen, die im Innenohr existieren können, wieder aufgenommen werden können13. Ein zweiter Ansatz bestand darin, außerhalb von Säugetieren auf Nicht-Säugetier-Wirbeltiere zu schauen, bei denen eine robuste Regeneration von Gehörhaarzellen stattfindet, wie z.B. Vögel14,15. Bei Vögeln erfolgt die Haarzellregeneration überwiegend durch die Dedifferenzierung einer Stützzelle in einen vorläuferähnlichen Zustand, gefolgt von einer asymmetrischen mitotischen Teilung zur Erzeugung einer Haarzelle und einer Stützzelle16. Darüber hinaus wurde auch eine direkte Differenzierung einer Stützzelle zur Erzeugung einer Haarzelle beobachtet17.
Während die Mechanismen der auditiven Entwicklung von Vögeln signifikante Ähnlichkeiten mit denen von Säugetieren aufweisen, gibt es Unterschiede18. Die HC- und SC-Differenzierung beim Küken-BP ist ab dem embryonalen Tag (E) 7 erkennbar und wird im Laufe der Zeit deutlicher. Durch E12 kann eine gut strukturierte und gut polarisierte Basilarpapille (BP) sichtbar gemacht werden, und durch E17 können gut entwickelte Haarzellen gesehen werden19. Diese Zeitpunkte bieten Fenster in die Mechanismen der Differenzierung, Strukturierung und Polarität sowie in die Reifung der Haarzellen. Es ist wichtig zu verstehen, ob solche Mechanismen konserviert oder divergent sind, da sie Einblicke in die tiefe Homologie der Ursprünge mechanosensorischer Haarzellen geben.
Hier demonstrieren wir eine Reihe von Techniken, die in frühen und späten embryonalen Stadien durchgeführt werden, um zelluläre Prozesse wie Proliferation, Schicksalsspezifikation, Differenzierung, Musterung und Aufrechterhaltung während der gesamten Entwicklung des Innenohrorgans zu untersuchen. Dies ergänzt andere Protokolle zum Verständnis der Innenohrentwicklung in der Explantatkultur20,21,22. Wir diskutieren zunächst die Einführung von exogener DNA oder RNA in BP-Vorläufer innerhalb der E3.5-Otozyste unter Verwendung der In-Ovo-Elektroporation. Obwohl genetische Manipulationen wertvolle Erkenntnisse liefern können, können die so erzeugten Phänotypen pleiotrop und folglich verwirrend sein. Dies gilt insbesondere für die spätere Innenohrentwicklung, wo grundlegende Prozesse wie der Umbau des Zytoskeletts vielfältige Rollen bei der Zellteilung, der Gewebemorphogenese und der zellulären Spezialisierung spielen. Wir präsentieren Protokolle zur pharmakologischen Hemmung in kultivierten Explantaten, die Vorteile bei der Kontrolle von Dosierung und Behandlungszeitpunkt und -dauer bieten und eine präzise raumzeitliche Manipulation von Entwicklungsmechanismen ermöglichen.
Je nach Behandlungsdauer kleiner Inhibitoren können unterschiedliche Organkulturmethoden eingesetzt werden. Hier zeigen wir zwei Methoden der Organkultur, die Einblicke in die epitheliale Morphogenese und zelluläre Spezialisierung ermöglichen. Eine Methode zur 3D-Kultur mit Kollagen als Matrix zur Kultur des Cochlea-Gangs ermöglicht eine robuste Kultivierung und Live-Visualisierung des sich entwickelnden BP. Um die Bildung von Stereozilien zu verstehen, stellen wir eine Membrankulturmethode vor, bei der Epithelgewebe auf einer steifen Matrix kultiviert wird, so dass Aktinvorsprünge frei wachsen können. Beide Methoden ermöglichen die Weiterverarbeitung wie Lebendzellbildgebung, Immunhistochemie, Rasterelektronenmikroskopie (REM), Zellaufzeichnung usw. Diese Techniken bieten eine Roadmap für die effektive Nutzung des Kükens als Modellsystem, um die Entwicklung, Reifung und Regeneration des aviären Gehörepithels zu verstehen und zu manipulieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Küken ist eine kostengünstige und bequeme Ergänzung zu den Modellorganismen, mit denen ein Labor das Innenohr erforschen kann. Die hier beschriebenen Methoden werden routinemäßig in unserem Labor eingesetzt und ergänzen die laufende Forschung im Innenohr von Säugetieren. In der Ovo wird Elektroporation verwendet, um genetische Manipulationen in das Kükengenom einzuführen. Die Elektroporation kann auch verwendet werden, um Konstrukte einzuführen, die fluoreszierende Proteine kodieren, die auf bestim…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Ihnen für die Unterstützung von NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB und dem Royal National Institute for the Deaf. Wir möchten uns bei der Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru, bedanken. Wir danken dem CIFF und der EM-Einrichtung und der Laborunterstützung bei NCBS. Wir danken Yoshiko Takahashi und Koichi Kawakami für die Tol2-eGFP- und T2TP-Konstrukte und Guy Richardson für HCA und G19 Pcdh15-Antikörper. Wir danken den Earlab-Mitgliedern für ihre ständige Unterstützung und ihr wertvolles Feedback zum Protokoll.
Materials
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
Referências
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