Metodi Ovo ed Ex Ovo per studiare lo sviluppo dell'orecchio interno aviario
Summary
Il pulcino è un organismo modello economico, accessibile e ampiamente disponibile per una varietà di studi. Qui, una serie di protocolli è dettagliata per comprendere i meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della rigenerazione dell’orecchio interno aviario.
Abstract
L’orecchio interno percepisce il suono e mantiene l’equilibrio usando la coclea e il vestibolo. Lo fa utilizzando un tipo di cellula meccanosensoriale dedicata nota come cellula ciliata. La ricerca di base nell’orecchio interno ha portato a una profonda comprensione di come funziona la cellula ciliata e di come la disregolazione può portare a perdita dell’udito e vertigini. Per questa ricerca, il topo è stato il sistema modello preminente. Tuttavia, i topi, come tutti i mammiferi, hanno perso la capacità di sostituire le cellule ciliate. Pertanto, quando si cerca di comprendere le terapie cellulari per ripristinare la funzione dell’orecchio interno, studi complementari in altre specie di vertebrati potrebbero fornire ulteriori approfondimenti. L’epitelio uditivo degli uccelli, la papilla basilare (BP), è un foglio di epitelio composto da cellule ciliate meccanosensoriali (HC) intercalate da cellule di supporto (SC). Sebbene l’architettura anatomica della papilla basilare e della coclea dei mammiferi differisca, i meccanismi molecolari dello sviluppo dell’orecchio interno e dell’udito sono simili. Questo rende la papilla basilare un sistema utile non solo per studi comparativi, ma anche per comprendere la rigenerazione. Qui, descriviamo le tecniche di dissezione e manipolazione per l’orecchio interno del pollo. La tecnica mostra metodi di inibizione genetica e di piccole molecole, che offrono un potente strumento per studiare i meccanismi molecolari dello sviluppo dell’orecchio interno. In questo articolo, discutiamo in ovo tecniche di elettroporazione per perturbare geneticamente la papilla basilare usando delezioni CRIPSR-Cas9, seguite dalla dissezione della papilla basilare. Dimostriamo anche la coltura dell’organo BP e l’uso ottimale delle matrici di coltura, per osservare lo sviluppo dell’epitelio e delle cellule ciliate.
Introduction
L’orecchio interno di tutti i vertebrati deriva da un semplice epitelio noto come placode otico 1,2. Ciò darà origine a tutti gli elementi strutturali e ai tipi cellulari necessari per trasdurre le informazioni meccanosensoriali associate all’udito e all’equilibrio della percezione. Le cellule ciliate (HC), il sensore ciliato dell’orecchio interno, sono circondate da cellule di supporto (SC). Gli HC trasmettono informazioni al cervello posteriore uditivo attraverso i neuroni dell’ottavo nervo cranico. Questi sono anche generati dal placode otico3. La trasduzione primaria del suono si ottiene sulla superficie apicale dell’HC uditivo, attraverso un fascio di capelli meccanicamente sensibile4. Questo è mediato attraverso protrusioni modificate a base di actina chiamate stereociglia, che sono disposte in un modello graduato di scala5. Inoltre, un ciglio primario modificato, chiamato kinocilium, organizza la formazione di fasci di capelli ed è adiacente alla fila più alta di stereociglia 6,7,8. L’architettura delle stereociglia è fondamentale per questo ruolo nella conversione di stimoli meccanici derivati dall’energia acustica in segnali neurali elettrici9. Danni all’HC uditivo dovuti all’invecchiamento, all’infezione, al trauma otoacustico o allo shock ototossico possono provocare una perdita parziale o completa dell’udito che, nei mammiferi, è irreversibile10.
Sono state proposte terapie cellulari sostitutive che potrebbero riparare tali danni11,12. L’approccio di questa ricerca è stato quello di comprendere il normale sviluppo della cellula ciliata dei mammiferi e chiedere se i programmi di sviluppo possono essere riavviati in cellule simili a progenitori che possono esistere all’interno dell’orecchio interno13. Un secondo approccio è stato quello di guardare al di fuori dei mammiferi, ai vertebrati non mammiferi in cui avviene una robusta rigenerazione delle cellule ciliate uditive, come gli uccelli14,15. Negli uccelli, la rigenerazione delle cellule ciliate avviene prevalentemente attraverso la de-differenziazione di una cellula di supporto in uno stato simile a un progenitore, seguita da una divisione mitotica asimmetrica per generare una cellula ciliata e una cellula di supporto16. Inoltre, è stata osservata anche la differenziazione diretta di una cellula di supporto per generare una cellula ciliata17.
Mentre i meccanismi dello sviluppo uditivo aviario mostrano somiglianze significative con quello dei mammiferi, ci sono differenze18. La differenziazione di HC e SC nel pulcino BP è evidente dal giorno embrionale (E) 7, diventando più distinta nel tempo. Con E12, è possibile visualizzare una papilla basilare (BP) ben modellata e ben polarizzata, e da E17 si possono vedere cellule ciliate ben sviluppate19. Questi punti temporali forniscono finestre sui meccanismi di differenziazione, pattern e polarità, nonché sulla maturazione delle cellule ciliate. Capire se tali meccanismi sono conservati o divergenti è importante, in quanto forniscono informazioni sulla profonda omologia delle origini delle cellule ciliate meccanosensoriali.
Qui, dimostriamo una serie di tecniche eseguite nelle fasi embrionali iniziali e tardive per studiare i processi cellulari come la proliferazione, la specifica del destino, la differenziazione, il pattern e il mantenimento durante lo sviluppo dell’organo dell’orecchio interno. Questo integra altri protocolli sulla comprensione dello sviluppo dell’orecchio interno nella coltura di espianti20,21,22. Per prima cosa discutiamo l’introduzione di DNA esogeno o RNA nei precursori della BP all’interno dell’otocisti E3.5 utilizzando l’elettroporazione ovo. Sebbene le manipolazioni genetiche possano fornire preziose informazioni, i fenotipi così generati possono essere pleiotropici e di conseguenza confondenti. Ciò è particolarmente vero durante il successivo sviluppo dell’orecchio interno, dove processi fondamentali come il rimodellamento citoscheletrico svolgono molteplici ruoli nella divisione cellulare, nella morfogenesi dei tessuti e nella specializzazione cellulare. Presentiamo protocolli per l’inibizione farmacologica negli espianti in coltura, che offrono vantaggi nel controllo del dosaggio e dei tempi e della durata del trattamento, offrendo una precisa manipolazione spaziotemporale dei meccanismi di sviluppo.
Diversi metodi di coltura degli organi possono essere utilizzati a seconda della durata del trattamento di piccoli inibitori. Qui dimostriamo due metodi di coltura degli organi che consentono approfondimenti sulla morfogenesi epiteliale e sulla specializzazione cellulare. Un metodo per la coltura 3D che utilizza il collagene come matrice per coltivare il dotto cocleare consente una coltura robusta e una visualizzazione dal vivo della BP in via di sviluppo. Per comprendere la formazione di stereociglia, presentiamo un metodo di coltura a membrana tale che il tessuto epiteliale viene coltivato su una matrice rigida che consente alle protrusioni di actina di crescere liberamente. Entrambi i metodi consentono l’elaborazione a valle come l’imaging di cellule vive, l’immunoistochimica, la microscopia elettronica a scansione (SEM), la registrazione cellulare, ecc. Queste tecniche forniscono una tabella di marcia per l’uso efficace del pulcino come sistema modello per comprendere e manipolare lo sviluppo, la maturazione e la rigenerazione dell’epitelio uditivo aviario.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il pulcino è un’aggiunta economica e conveniente agli organismi modello che un laboratorio può utilizzare per la ricerca sull’orecchio interno. I metodi qui descritti sono abitualmente utilizzati nel nostro laboratorio e completano la ricerca in corso nell’orecchio interno dei mammiferi. Nell’ovo l’elettroporazione viene utilizzata per introdurre manipolazioni genetiche nel genoma del pulcino. L’elettroporazione può anche essere usata per introdurre costrutti che codificano proteine fluorescenti mirate a part…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Riconosciamo con gratitudine il supporto di NCBS, TIFR, Infosys-TIFR Leading Edge Research Grant, DST-SERB e Royal National Institute for the Deaf. Vorremmo ringraziare Central Poultry Development Organization and Training Institute, Hesaraghatta, Bengaluru. Siamo grati al supporto di CIFF e EM facility and lab presso NCBS. Ringraziamo Yoshiko Takahashi e Koichi Kawakami per i costrutti Tol2-eGFP e T2TP, e Guy Richardson per l’HCA e l’anticorpo G19 Pcdh15. Siamo grati ai membri di Earlab per il loro costante supporto e prezioso feedback sul protocollo.
Materials
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3 | Integrated DNA Technologies | 1081061 | High fidelity Cas9 protein |
| Anti-GFP antibody | Abcam | ab290 | Rabbit polyclonal to GFP |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Calcium Chloride Dihydrate | Thermo Fisher Scientific | Q12135 | |
| Collagen I, rat tail | Thermo Fisher Scientific | A1048301 | |
| Critical Point Dryer Leica EM CPD300 | Leica | ||
| CUY-21 Electroporator | Nepagene | ||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DM5000B Widefield Microscope | Leica | ||
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 10569010 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Fluoroshield | Sigma-Aldrich | F6182 | |
| FLUOVIEW 3000 Laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Glutaraldehyde (25 %) | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11001 | |
| Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11032 | |
| Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| Goat Serum Sterile filtered | HiMedia | RM10701 | Heat inactivated |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
| LSM980 Airyscan Microscope | Zeiss | ||
| Millicell Cell Culture Insert, 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm | Sigma-Aldrich | PICM03050 | |
| MVX10 Stereo Microscope | Olympus | ||
| MYO7A antibody | DSHB | 138-1 | Mouse monoclonal to Unconventional myosin-VIIa |
| MZ16 Dissecting microscope | Leica | ||
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Noyes Scissors, 14cm (5.5'') | World Precision Instruments | 501237 | |
| Osmium tetroxide (4%) | Sigma-Aldrich | 75632 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PC-10 Puller | Narishige | ||
| pcU6_1sgRNA | Addgene | 92395 | Mini vector with modified chicken U6 promoter |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36934 | |
| SMZ1500 Dissecting microscope | Nikon | ||
| Sodium Cacodylate Buffer, 0.2M | Electron Microscopy Sciences | 11652 | |
| Sodium chloride | HiMedia | GRM853 | |
| Sputtre Coater K550X | Emitech | ||
| Standard Glass Capillaries 3 in, OD 1.0 mm, No Filament | World Precision Instruments | 1B100-3 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| The MERLIN Compact VP | Zeiss | ||
| Thiocarbohydrazide | Alfa Aesar | L01205 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
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