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Developmental Biology

बरकरार ज़ेबराफिश भ्रूण के भीतर सामान्य और असामान्य साइटोसिन मिथाइलेशन की त्वरित और कुशल स्थानिक निगरानी

Published: August 18, 2022 doi: 10.3791/64190
Automatic Translation
1, 1
1Department of Environmental Sciences, University of California, Riverside

Summary

यह पेपर बरकरार जेब्राफिश भ्रूण के भीतर सामान्य और असामान्य साइटोसिन मिथाइलेशन की तेजी से और कुशल स्थानिक निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

Abstract

साइटोसिन मिथाइलेशन कशेरुक प्रजातियों में अत्यधिक संरक्षित है और, एपिजेनेटिक प्रोग्रामिंग और क्रोमैटिन स्थिति के एक प्रमुख चालक के रूप में, प्रारंभिक भ्रूण के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एंजाइमेटिक संशोधन 5-मिथाइलसाइटोसिन (5-एमसी) में साइटोसिन के सक्रिय मिथाइलेशन और डिमिथाइलेशन को चलाते हैं और बाद में 5-एमसी के ऑक्सीकरण को 5-हाइड्रॉक्सीमिथाइलसाइटोसिन, 5-फॉर्मिलसाइटोसिन और 5-कार्बोक्सिलसाइटोसिन में करते हैं। एपिजेनेटिक रीप्रोग्रामिंग गर्भाशय के विकास के दौरान एक महत्वपूर्ण अवधि है, और रसायनों के मातृ संपर्क में संतानों के भीतर एपिजीनोम को पुन: प्रोग्राम करने की क्षमता होती है। यह संभावित रूप से प्रतिकूल परिणामों का कारण बन सकता है जैसे कि तत्काल फेनोटाइपिक परिणाम, वयस्क रोग संवेदनशीलता पर दीर्घकालिक प्रभाव, और विरासत में मिले एपिजेनेटिक निशान के ट्रांसजेनरेशनल प्रभाव। यद्यपि बिसल्फाइट-आधारित अनुक्रमण जांचकर्ताओं को बेस-जोड़ी संकल्प पर साइटोसिन मिथाइलेशन से पूछताछ करने में सक्षम बनाता है, अनुक्रमण-आधारित दृष्टिकोण लागत-निषेधात्मक हैं और इस तरह, विकास चरणों में साइटोसिन मिथाइलेशन की निगरानी करने की क्षमता को रोकते हैं, प्रति रासायनिक कई सांद्रता, और प्रति उपचार भ्रूण को दोहराते हैं। भ्रूणजनन के दौरान विवो इमेजिंग, आनुवंशिक जोड़तोड़, तेजी से गर्भाशय विकास समय और पशुपालन में स्वचालित की आसानी के कारण, जेब्राफिश भ्रूण का उपयोग ज़ेनोबायोटिक-मध्यस्थता मार्गों को उजागर करने के लिए शारीरिक रूप से बरकरार मॉडल के रूप में किया जाता है जो प्रारंभिक भ्रूण के विकास के दौरान प्रतिकूल परिणामों में योगदान करते हैं। इसलिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 5-एमसी-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, हम सांख्यिकीय विश्लेषण से पहले प्रोग्रामिंग भाषा का उपयोग करके व्यक्तिगत, बरकरार जेब्राफिश भ्रूण के भीतर साइटोसिन मिथाइलेशन की तेजी से और कुशल स्थानिक निगरानी के लिए एक लागत प्रभावी रणनीति का वर्णन करते हैं। वर्तमान ज्ञान के लिए, यह विधि प्रारंभिक विकास के दौरान ज़ेब्राफिश भ्रूण के भीतर सीटू में 5-एमसी स्तरों का सफलतापूर्वक पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने वाली पहली है। विधि सेल द्रव्यमान के भीतर डीएनए मिथाइलेशन का पता लगाने में सक्षम बनाती है और मातृ-से-युग्मनज संक्रमण के दौरान जर्दी-स्थानीयकृत मातृ एमआरएनए के साइटोसिन मिथाइलेशन का पता लगाने की क्षमता भी है। कुल मिलाकर, यह विधि उन रसायनों की तेजी से पहचान के लिए उपयोगी होगी जो एपिजेनेटिक रीप्रोग्रामिंग के दौरान सीटू में साइटोसिन मिथाइलेशन को बाधित करने की क्षमता रखते हैं।

Introduction

एंजाइमेटिक संशोधन 5-मिथाइलसाइटोसिन (5-एमसी) में साइटोसिन के सक्रिय मिथाइलेशन और डिमिथाइलेशन को चलाते हैं और बाद में 5-एमसी के ऑक्सीकरण को 5-हाइड्रॉक्सीमिथाइलसाइटोसिन, 5-फॉर्मिलसाइटोसिन और 5-कार्बोक्सिलसाइटोसिन 1,2 में करते हैं। ट्राइस (1,3-डाइक्लोरो-2-प्रोपाइल) फॉस्फेट (टीडीसीआईपीपी) संयुक्त राज्य अमेरिका में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला लौ रोधी है जिसे पहले प्रारंभिक गैस्ट्रुलेशन (6 एचपीएफ) 3,4,5,6,7,8 के माध्यम से 0.75 घंटे बाद निषेचन (एचपीएफ) से प्रारंभिक भ्रूण के संपर्क में आने के बाद साइटोसिन मिथाइलेशन के प्रक्षेपवक्र को बदलने के लिए प्रदर्शित किया गया है। . कशेरुकियों के भीतर, 5-एमसी और इसके संशोधित डेरिवेटिव प्रारंभिकभ्रूण के विकास को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। भ्रूण के निषेचन से माता-पिता के डीएनए का डिमिथाइलेशन शुरू होता है, इसके बाद मातृ एमआरएनए क्षरण, युग्मनज जीनोम सक्रियण और युग्मनज जीनोम 9 का रीमिथाइलेशन होताहै। जैविक रूप से प्रासंगिक प्रक्रियाएं जो साइटोसिन मिथाइलेशन का उपयोग करती हैं, उनमें हिस्टोन संशोधन, ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी की भर्ती, आरएनए मिथाइलेशन, एपिजेनेटिक रीप्रोग्रामिंग और क्रोमैटिन संरचना10,11 का निर्धारण शामिल है। साइटोसिन मिथाइलेशन को कशेरुक प्रजातियों के बीच भी संरक्षित किया जाता है, जो यह समझने और जांच करने के महत्व को रेखांकित करता है कि असामान्य साइटोसिन मिथाइलेशन किसी जीव के विकास के प्रक्षेपवक्र को कैसे प्रभावित कर सकताहै। इसके अलावा, गर्भाशय विकास में मातृ जोखिम के प्रति संवेदनशील होता है और इसमें प्रतिकूल परिणाम पैदा करने की क्षमता होती है जैसे कि तत्काल फेनोटाइपिक परिणाम, वयस्क रोग संवेदनशीलता पर दीर्घकालिक प्रभाव, और विरासत में मिले एपिजेनेटिक अंक 12,13,14 के ट्रांसजेनरेशनल प्रभाव।

साइटोसिन-गुआनिन जोड़े, या सीपीजी द्वीपों के लंबे खंड, जांचकर्ताओं के प्राथमिक केंद्र रहे हैं जिनका उद्देश्य जीनोम 15,16,17 में साइटोसिन मिथाइलेशन की गतिशीलता को चिह्नित करना है। बिसल्फाइट-आधारित रणनीतियां जैसे कि पूरे जीनोम बाइसल्फाइट अनुक्रमण, कम प्रतिनिधित्व बाइसल्फाइट अनुक्रमण, और बिसल्फाइट एम्प्लिकॉन अनुक्रमण बेस-जोड़ी रिज़ॉल्यूशन पर साइटोसिन मिथाइलेशन से पूछताछ के लिए स्वर्ण मानक का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, अनुक्रमण-आधारित दृष्टिकोण लागत-निषेधात्मक हैं और, इस तरह, विकास के चरणों में साइटोसिन मिथाइलेशन की निगरानी करने, प्रति रसायन कई सांद्रता और प्रति उपचार भ्रूण को दोहराने की क्षमता को रोकते हैं। इसके अलावा, अनुक्रमण-आधारित दृष्टिकोण स्थानिक स्थानीयकरण के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं, जो एक विकासशील भ्रूण के भीतर संभावित रूप से प्रभावित सेल प्रकारों और क्षेत्रों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इसी तरह, मिथाइलेशन-निर्भर प्रतिबंध विश्लेषण, 5-एमसी एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोएसे (ईएलआईएसए), और 5-मिथाइल-2'-डीऑक्सीसाइटिडीन (5-एमसी) तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) जैसे वैश्विक डीएनए मिथाइलेशन परख सेल या ऊतक होमोजेनेट्स पर भरोसा करते हैं और इस तरह, बरकरार नमूनोंके भीतर अंतरिक्ष और समय पर साइटोसिन मिथाइलेशन के स्थानीयकरण और परिमाण की निगरानी करने की क्षमता को रोकते हैं।

भ्रूणजनन के दौरान विवो इमेजिंग, आनुवंशिक जोड़तोड़, तेजी से गर्भाशय विकास समय और पशुपालन में स्वचालित की आसानी के कारण, जेब्राफिश भ्रूण को व्यापक रूप से ज़ेनोबायोटिक-मध्यस्थता मार्गों को उजागर करने के लिए शारीरिक रूप से बरकरार मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है जो प्रारंभिक भ्रूण के विकास के दौरान प्रतिकूल परिणामों में योगदान करते हैं। इसलिए, 5-एमसी के लिए विशिष्ट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, नीचे दिया गया प्रोटोकॉल सांख्यिकीय विश्लेषण से पहले प्रोग्रामिंग भाषा का उपयोग करके व्यक्तिगत, बरकरार जेब्राफिश भ्रूण के भीतर साइटोसिन मिथाइलेशन की तेजी से और कुशल स्थानिक निगरानी के लिए एक लागत प्रभावी रणनीति का वर्णन करता है।

वर्तमान ज्ञान के लिए, यह विधि बरकरार ज़ेबराफिश भ्रूण के भीतर 5-एमसी की निगरानी करने वाली पहली है। विधि सेल द्रव्यमान के भीतर डीएनए मिथाइलेशन का पता लगाने में सक्षम बनाती है और मातृ-से-युग्मनज संक्रमण के दौरान जर्दी-स्थानीयकृत मातृ एमआरएनए के साइटोसिन मिथाइलेशन का पता लगाने की क्षमता भी है। कुल मिलाकर, यह विधि उन रसायनों की तेजी से पहचान के लिए उपयोगी होगी जो एपिजेनेटिक रीप्रोग्रामिंग के दौरान सीटू में साइटोसिन मिथाइलेशन को बाधित करने की क्षमता रखते हैं।

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Protocol

वयस्क प्रजनकों को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, रिवरसाइड में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) -अनुमोदित पशु उपयोग प्रोटोकॉल (# 20180063) के अनुसार संभाला और इलाज किया गया था।

1. ज़ेबराफिश भ्रूण संग्रह और रासायनिक जोखिम

  1. यौन रूप से परिपक्व और प्रजनन रूप से व्यवहार्य वयस्क नर और मादा ज़ेबराफिश वाले टैंकों में इन-टैंक प्रजनन जाल जोड़ें। ~ 9:00 बजे संग्रह से कम से कम 12 घंटे पहले प्रति 6 एल टैंक में कम से कम तीन जाल जोड़ें, जो टैंक के भीतर निषेचन और अंडे के प्रजनन का अनुमानित समय है।
  2. संग्रह की सुबह एक ताजा एक्सपोजर समाधान तैयार करें। एक्सपोजर समाधान 5 एमएल पिपेट का उपयोग करके तैयार किया जाता है और 60 मिमी ग्लास पेट्री डिश में 5.0 एमएल पार्टिकुलेट-फ्री सिस्टम पानी जोड़ता है।
  3. फिर, ग्लास डिश में सिस्टम पानी में 10 μL वाहन (डाइमिथाइल सल्फोक्साइड, या DMSO) या रासायनिक स्टॉक समाधान को स्थानांतरित करने के लिए 10 μL ग्लास माइक्रोकेशिका पिपेट का उपयोग करें।
  4. स्टॉक समाधान को समाप्त करने के लिए ग्लास पेट्री डिश को घुमाएं। ग्लास पेट्री डिश में एक और 5.0 एमएल सिस्टम पानी जोड़ें। एक्सपोज़र समाधान को समरूप बनाने के लिए ग्लास पेट्री डिश को घुमाएं।
  5. प्रत्येक उपचार समूह के लिए चार प्रतिकृतियां प्रति उपचार चार प्रतिकृतियां प्राप्त करने के लिए दोहराएं।
  6. एक्सपोजर समाधान तैयार होने के बाद, वाष्पीकरण को कम करने के लिए कांच के ढक्कन के साथ कांच के व्यंजनों को कैप करें।
  7. प्रत्येक टैंक से प्रजनन जाल को हटाते समय, टैंकों से हटाने से पहले प्रत्येक जाल के भीतर पानी को टैंक में बाहर निकालने की सावधानीपूर्वक अनुमति दें। सुनिश्चित करें कि जाल दाईं ओर रहते हैं।
  8. प्रजनन जाल को प्रयोगशाला सिंक में स्थानांतरित करें और रिवर्स ऑस्मोसिस (आरओ) पानी से भरी एक धाराप्रवाह बोतल का उपयोग करके उन्हें मछली के जाल में कुल्ला करें जिसे पहले 10% ब्लीच में भिगोया गया था और पानी से धोया गया था। भ्रूण को तब तक कुल्ला करें जब तक कि सभी मलबे साफ न हो जाएं और केवल साफ भ्रूण न रह जाएं।
  9. आरओ पानी से भरी धारा की बोतल का उपयोग करके मछली जाल से भ्रूण को 100 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश में स्थानांतरित करें। निषेचन के बाद (एचपीएफ) 0.75 घंटे पर यादृच्छिक रूप से 50 जीवित भ्रूण को क्रमबद्ध करें और अतिरिक्त आरओ पानी को हटा दें।
  10. माइक्रोस्पैटुला का उपयोग करके, क्रमबद्ध भ्रूण को उपचार समाधान में रखें। सभी भ्रूण वाहन या उपचार समाधान के भीतर 9:45 बजे से पहले नहीं होना चाहिए। यह सुनिश्चित करने के लिए कांच के व्यंजनों को घुमाएं कि भ्रूण उपचार समाधान के भीतर समान रूप से लेपित हैं।
  11. प्रत्येक उपचार समूह के लिए चार प्रतिकृति व्यंजन (एन = 50 प्रति प्रतिकृति) स्थापित किए जाने के बाद, एक्सपोजर व्यंजनों के शीर्ष पर ग्लास ढक्कन रखें और सभी व्यंजनों को 28 डिग्री सेल्सियस पर 2 एचपीएफ, 4 एचपीएफ, 6 एचपीएफ, 8 एचपीएफ, या 10 एचपीएफ तक तापमान-नियंत्रित इनक्यूबेटर सेट में स्थानांतरित करें।
  12. एक्सपोजर समाप्ति से कम से कम 4 घंटे पहले ताजा 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    1. हॉटप्लेट को 115 डिग्री सेल्सियस पर चालू करें, 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 20 एमएल 1एक्स फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) (10x PBS का 2 एमएल + 18 एमएल आरओ पानी) बनाएं, और 800 मिलीग्राम पैराफॉर्मलडिहाइड का वजन निकालें।
    2. एक रासायनिक फ्यूम हुड के भीतर, 1x PBS घोल को 250 mL Erlenmeyer फ्लास्क में स्थानांतरित करें, 800 मिलीग्राम पैराफॉर्मलडिहाइड जोड़ें, और फिर 10 N NaOH के 2 μL जोड़ें। फ्लास्क के अंदर एक थर्मामीटर रखें, फ्लास्क को गर्म प्लेट पर रखें, और हिलाते समय तापमान देखें।
    3. जब तापमान 62-65 डिग्री तक पहुंच जाता है, तो गर्म प्लेट से 4% पीएफए को हटा दें और इसे कमरे के तापमान (आरटी) पर ठंडा होने दें। 4% PFA को 4 °C पर स्टोर करें।
  13. एक बार एक्सपोज़र अवधि समाप्त हो जाने के बाद, इनक्यूबेटर से भ्रूण को हटा दें और सभी जीवित भ्रूणों को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके एस्पिरेटेड अवशिष्ट एक्सपोजर समाधान। किसी भी भ्रूण को न पीएं।
  14. 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 500 μL ठंडा 4% PFA जोड़ें और भ्रूण को 4% PFA में कई बार इंजेक्ट करके मिलाएं। भ्रूण को रात भर 4% पीएफए में ठीक करने की अनुमति दें।
    नोट: भ्रूण को 12 घंटे से अधिक समय तक पीएफए में रहने की अनुमति देने की सिफारिश नहीं की जाती है।

2. भ्रूण का विघटन

  1. अगले दिन, 4% पीएफए को एस्पिरेट करें, भ्रूण को 1x PBS में पुन: निलंबित करें, और धीरे से 30 सेकंड के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें। यदि आवश्यक हो, तो इस चरण में प्रोटोकॉल को रोकें और भ्रूण को 48 घंटे तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x PBS में संग्रहीत करें।
  2. प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके, निश्चित भ्रूण को आरओ पानी से भरे ग्लास डिश में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें और धीरे से 30 सेकंड के लिए घुमाएं। इस चरण को एक बार और दोहराएं।
  3. सभी भ्रूणों को मैन्युअल रूप से डीकोरियोनेट करने के लिए एक मानक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग करके 5.0x आवर्धन के तहत सिरिंज सुइयों का उपयोग करें। कोरियन को पंचर करने के लिए सुई टिप का उपयोग करके ऐसा करें और धीरे से इसे जर्दी और सेल द्रव्यमान4 से दूर छील लें।
  4. एक बार जब भ्रूण को डिकोराइड कर दिया जाता है, तो एक इम्यूनोकैमिस्ट्री (आईएचसी) टोकरी में 25 बरकरार भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए एक ग्लास माइक्रोकेशिका पिपेट का उपयोग करें और आईएचसी टोकरी को 96-वेल प्लेट में रखें। प्रत्येक कुएं से आरओ पानी को एस्पिरेट करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें।

3. 5-एमसी-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

  1. भ्रूण को प्रति अच्छी तरह से ब्लॉकिंग बफर (1x PBST + 2% भेड़ सीरम + 2 mg / mL गोजातीय सीरम एल्बुमिन) के 500 μL में पुन: निलंबित करें, और उन्हें प्रकाश से बचाने के लिए पैराफिल्म और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लेट लपेटें। कक्षीय शेकर (100 आरपीएम) पर 4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  2. पैराफिल्म रैप और एल्यूमीनियम को हटा दें और प्रत्येक कुएं से ब्लॉकिंग बफर को एस्पिरेट करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें। इसे ब्लॉकिंग बफर में मोनोक्लोनल माउस एंटी-5-एमसी एंटीबॉडी के 1:100 कमजोर पड़ने के 500 μL के साथ बदलें। वाहन नियंत्रण भ्रूण के एक उप-समूह को छोड़कर प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सभी भ्रूणों को इनक्यूबेट करें, जिन्हें पृष्ठभूमि शोर के लिए ब्लॉकिंग बफर के साथ इनक्यूबेट किया जाएगा। सावधान रहें कि भ्रूण की अखंडता को बाधित न करें, न ही इस चरण के दौरान एस्पिरेट भ्रूण।
  3. प्लेट को पैराफिल्म और एल्यूमीनियम पन्नी में फिर से लपेटें और प्लेट को कक्षीय शेकर (100 आरपीएम) पर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
  4. अगले दिन, प्रत्येक कुएं से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें और इसे 1x PBS + 0.1% ट्वीन -20 (1x PBST) के साथ बदलें। कक्षीय शेकर (100 आरपीएम) पर 15 मिनट प्रति धोने के लिए 1x PBST के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से तीन बार धोएं।
  5. बफर को अवरुद्ध करने में बकरी एंटी-माउस आईजीजी एंटीबॉडी के 1:500 कमजोर पड़ने के साथ 1x PBST को बदलें और द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ सभी भ्रूणों को इनक्यूबेट करें। प्लेट को कक्षीय शेकर (100 आरपीएम) पर रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने दें।
  6. अगले दिन, द्वितीयक एंटीबॉडी को हटा दें और अवशिष्ट घोल को 1x PBST के साथ 15 मिनट प्रति वॉश के लिए कक्षीय शेकर (100 आरपीएम) पर तीन बार धोएं।
    नोट: प्रोटोकॉल को यहां 48 घंटे तक रोका जा सकता है यदि आईएचसी टोकरी 1x PBS से भरे साफ कुओं में संग्रहीत की जाती है।
  7. प्रत्येक कुएं से 1x PBST को एस्पिरेट करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग करें और आईएचसी टोकरी को आरओ पानी से भरे ग्लास पेट्री डिश में रखें। एक मानक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, यादृच्छिक रूप से बरकरार भ्रूण को 96-वेल प्लेट में क्रमबद्ध करें, जिसके परिणामस्वरूप प्रति कुएं एक भ्रूण होता है।
  8. 1 एमएल पिपेट का उपयोग करके, अलग-अलग कुओं से सभी आरओ पानी को हटा दें और इसे 1x PBS के 200 μL के साथ बदलें। प्लेट को 1 x g पर 3 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें।

4. 96-वेल प्लेटों के भीतर भ्रूण की स्वचालित इमेजिंग

  1. उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग सिस्टम (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके प्रेषित प्रकाश और एफआईटीसी के तहत 2x उद्देश्य के साथ भ्रूण की छवि बनाएं।
    नोट: प्रत्येक भ्रूण की एक फ्लोरोसेंट छवि को उपर्युक्त आवर्धन और एफआईटीसी फिल्टर19 का उपयोग करके स्वचालित रूप से कैप्चर किया गया था।
    1. यह सुनिश्चित करने के लिए ऑटोफोकस का चयन करें कि कैमरे का फोकस प्लेट के निचले हिस्से पर है और नीचे की मोटाई से ऑफसेट है।
    2. 100 एमएस की एक्सपोजर अवधि के साथ एफआईटीसी तरंगदैर्ध्य का चयन करें, और ऑटोफोकस को जेड-ऑफसेट के साथ लेजर पर सेट करें। प्लेट अधिग्रहण शुरू करने से पहले कई कुओं में उचित छवि अधिग्रहण का निरीक्षण और पुष्टि करें।
      नोट: उपकरण स्वचालित रूप से भ्रूण युक्त सभी चयनित कुओं से छवियां प्राप्त करता है। छवि अधिग्रहण और डेटा भंडारण के लिए एक 96-वेल प्लेट को लगभग 30 मिनट की आवश्यकता होती है। अधिग्रहण अवधि की अवधि के लिए, इमेजिंग सिस्टम के भीतर आंतरिक तापमान आरटी में बनाए रखा गया था।
  2. छवि अधिग्रहण के बाद, उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग सिस्टम और एक कस्टम स्वचालित छवि विश्लेषण प्रक्रिया का उपयोग करके डेटा विश्लेषण करें। प्रतिदीप्ति के कुल क्षेत्र और एकीकृत तीव्रता के लिए विश्लेषण किए जाने के लिए 96-वेल प्लेट पर प्रत्येक भ्रूण का चयन करें।
    नोट: विश्लेषण में ऐसी छवियां प्रदान करना शामिल था जिनमें विश्लेषण से डेटा बिंदुओं के ओवरले शामिल थे।
  3. फिर, डेटा बिंदुओं को सारणीबद्ध करें और उन्हें माप के तहत जाकर और स्प्रेडशीट में ओपन डेटा लॉग का चयन करके उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग सिस्टम से निर्यात करें। प्लेट अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण भागों को चित्र 1 में दर्शाया गया है।

5. डेटा विश्लेषण

  1. निर्यात की गई स्प्रेडशीट को कंप्यूटर प्रोग्राम में अपलोड करें जहां तैनाती (dplyr) पैकेज का उपयोग प्रत्येक कुएं के लिए डेटा को सॉर्ट करने, सारांशित करने और अच्छी तरह से संख्या द्वारा फ़िल्टर करने के लिए किया जाता है। लेखनxl पैकेज का उपयोग तब स्प्रैडशीट में योगित डेटा निर्यात करने के लिए किया जाता है। 5 mC प्रोग्राम कोड पूरक फ़ाइल 1 में दिखाया गया है।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का समग्र उद्देश्य यह निर्धारित करना है कि क्या एक उपचार निश्चित और लेबल जेब्राफिश भ्रूण के भीतर प्रतिदीप्ति के कुल क्षेत्र और सापेक्ष तीव्रता का आकलन करके 5-एमसी की सापेक्ष बहुतायत को प्रभावित करता है। प्रोटोकॉल को पूरा करने के बाद, एक फ्लोरेसेंस स्टीरियोमाइक्रोस्कोप का उपयोग पहले यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि क्या पूरे माउंट आईएचसी सफल था। जब लेबल किए गए भ्रूण को एफआईटीसी या जीएफपी फिल्टर के तहत देखा जाता है, तो भ्रूण के भीतर एक सकारात्मक एफआईटीसी संकेत द्वारा एक सकारात्मक परिणाम का संकेत दिया जाता है, जबकि नियंत्रण भ्रूण के भीतर प्रतिदीप्ति की अनुपस्थिति से एक नकारात्मक परिणाम का संकेत मिलता है। एक उच्च-सामग्री स्क्रीनिंग सिस्टम का उपयोग करके, इन परिणामों की पुष्टि एफआईटीसी फ़िल्टर का उपयोग करके छवि अधिग्रहण के दौरान भी की जा सकती है। इसके अलावा, डेटा विश्लेषण के दौरान, कस्टम मॉड्यूल प्रतिदीप्ति के कुल क्षेत्र और एकीकृत तीव्रता की पहचान और मात्रा निर्धारित करेगा। सफल परिणामों की प्रतिनिधि छवियों को चित्रा 1 में दिखाया गया है, जहां अधिग्रहित छवियों को कस्टम मॉड्यूल द्वारा सफलतापूर्वक मापा गया था, और कुल क्षेत्र और एकीकृत तीव्रता दोनों के लिए व्यक्तिगत डेटा बिंदु (नीले ओवरले के रूप में दिखाए गए) प्राप्त किए गए थे।

डेटा निष्कर्षण के दौरान, कस्टम मॉड्यूल के भीतर थ्रेशोल्ड स्ट्रिंगेंसी एक अतिरिक्त चर है जिसे सिग्नल-टू-शोर अनुपात को अधिकतम करने और 5-एमसी बहुतायत में एक महत्वपूर्ण उपचार-विशिष्ट अंतर का पता लगाने की संभावना बढ़ाने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता है। अनुकूलन के दौरान, इस अंतिम सीमा ने नियंत्रण और उपचार समूहों के औसत के बीच सबसे महत्वपूर्ण पृथक्करण प्रदान किया (उदाहरण के लिए, सबसे बड़ा सिग्नल-टू-शोर अनुपात)। सिग्नल-टू-शोर अनुपात को प्रभावित करने वाले अलग-अलग कस्टम मॉड्यूल थ्रेसहोल्ड पर प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2 में प्रस्तुत किए गए हैं।

Figure 1
चित्रा 1: एक प्रवाह आरेख जो एक्सपोजर के लिए प्रोटोकॉल का ग्राफिकल प्रतिनिधित्व प्रदान करता है और 6 एचपीएफ जेब्राफिश भ्रूण के लिए 5-मिथाइलसाइटोसिन का पता लगाता है। प्रवाह आरेख की दिशा काले तीरों के साथ प्रदान की गई है। एक्सपोजर प्रति उपचार चार प्रतिकृति व्यंजनों और प्रति प्रतिकृति डिश 50 भ्रूण की प्रतिकृति में हुआ। संक्षिप्तीकरण: सेमी = सेल द्रव्यमान; ys = जर्दी थैली। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: कस्टम मॉड्यूल का अनुकूलन। पैनल ए-डी 6 एचपीएफ पर जेब्राफिश भ्रूण के भीतर 5-एमसी-विशिष्ट कुल क्षेत्र और एकीकृत तीव्रता के औसत और वितरण का आकलन करके कस्टम मॉड्यूल का अनुकूलन दिखाते हैं। (ए, बी) परीक्षण किए गए विभिन्न थ्रेसहोल्ड को किंवदंती में दाईं ओर सूचीबद्ध किया गया है (प्रत्येक सीमा के बीच 100 का अंतर) और स्ट्रिंगेंसी द्वारा आदेश दिया जाता है, जहां 1500 और 2500 क्रमशः परीक्षण किए गए सबसे कम और सबसे कठोर थ्रेसहोल्ड का प्रतिनिधित्व करते हैं। (C, D) परीक्षण किए गए विभिन्न थ्रेसहोल्ड को किंवदंती में दाईं ओर सूचीबद्ध किया गया है (प्रत्येक सीमा के बीच 250 का अंतर) और स्ट्रिंगेंसी द्वारा आदेश दिया गया है, जहां 1500 और 2500 क्रमशः परीक्षण किए गए सबसे कम और सबसे कठोर थ्रेसहोल्ड का प्रतिनिधित्व करते हैं। सी, डी में (*) थ्रेसहोल्ड को दर्शाता है जो वाहन-उपचारित भ्रूण (पी < 0.05) से काफी अलग हैं। ए, बी के लिए, परीक्षण की गई सभी थ्रेसहोल्ड वाहन नियंत्रण से महत्वपूर्ण थीं। एक्स-अक्ष या तो वाहन (0.1% डीएमएसओ) या 0.78 μM TDCIPP (सकारात्मक नियंत्रण) के संपर्क को दर्शाता है। वाई-अक्ष सापेक्ष प्रतिदीप्ति को दर्शाता है। पैनल ए उपचार के कार्य के रूप में भ्रूण के भीतर पाए गए 5-एमसी के कुल क्षेत्र को प्रदर्शित करता है, जबकि पैनल बी उसी क्षेत्र के भीतर 5-एमसी की एकीकृत तीव्रता प्रदर्शित करता है। प्रत्येक उपचार समूह के लिए कुल एन = 96 के लिए एक भ्रूण को एकल डेटा बिंदु द्वारा दर्शाया जाता है। सभी एक्सपोज़र प्रति ग्लास डिश 50 भ्रूण के साथ प्रति उपचार चार व्यंजनों की प्रतिकृति में किए गए थे। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: 5 mC प्रोग्राम कोड। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के दौरान, कुछ कदम हैं जो महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, भ्रूण को विघटित करते समय, सुई को भ्रूण / जर्दी थैली / सेल द्रव्यमान के ऊतक से दूर इंगित करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि विकासशील भ्रूण के ये हिस्से बहुत नाजुक और पंचर करने में आसान होते हैं। दूसरा, लेबल किए गए भ्रूण को अलग-अलग कुओं में स्थानांतरित करते समय, भ्रूण को स्थानांतरित करने के लिए ग्लास पिपेट का उपयोग करें क्योंकि वे प्लास्टिक पिपेट का पालन करेंगे। तीसरा, पूरे माउंट आईएचसी का प्रदर्शन करते समय, सुनिश्चित करें कि प्लेट प्रकाश से सुरक्षित है। अंत में, पूरे माउंट आईएचसी प्रोटोकॉल को पूरा करने के बाद, प्लेट को इमेजिंग से पहले रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 1x PBS में इनक्यूबेट करने की अनुमति दें, क्योंकि यह ऑटोफ्लोरेसेंस को कम करेगा जो इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकता है।

यदि ऐसे भ्रूण हैं जो विघटन या आईएचसी के दौरान अलग हो गए हैं, तो इन भ्रूणों को प्रोटोकॉल के शेष भाग से बाहर रखें। यदि कोई प्रतिदीप्ति का पता नहीं चलता है, तो इसे लंबे समय तक (16 घंटे तक) इनक्यूबेट करके हल किया जा सकता है। चूंकि यह एक 5-एमसी-विशिष्ट एंटीबॉडी है, इसलिए डीएनए और आरएनए दोनों को लेबल किया जा सकता है। स्थानिक स्थानीयकरण की एक सामान्य समझ महत्वपूर्ण है।

इस विधि में कुछ सीमाएँ हैं। सबसे पहले, यह एक गैर-लक्षित तकनीक है, जिसका अर्थ है कि यह 5-एमसी की सटीक मात्रा प्रदान नहीं करेगा, बल्कि प्रतिदीप्ति के कुल क्षेत्र और एकीकृत तीव्रता के आधार पर सापेक्ष बहुतायत प्रदान करेगा। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल को केवल विभाजन से पहले भ्रूण पर परीक्षण किया गया है, इसलिए यदि विकास के बाद के चरणों का परीक्षण किया जाता है, तो कुछ अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, चूंकि विधि आईएचसी-आधारित है, इसलिए यह गैर-विशिष्ट बंधन के लिए अतिसंवेदनशील हो सकता है; इसलिए, यह निश्चित नहीं है कि न केवल डीएनए के लिए स्थानीयकृत 5-एमसी धुंधला हो, बल्कि आरएनए के लिए स्थानीयकृत 5-एमसी भी धुंधला हो सकता है। अंत में, पसंद की जाने वाली स्थितियों के रासायनिक और कठोरता के आधार पर डेटा विश्लेषण सीमा के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है।

कुल मिलाकर, यह विधि विकास और रासायनिक सांद्रता के कई चरणों में 5-एमसी का त्वरित और लागत कुशल पता लगाने प्रदान करतीहै। इसलिए यह लागत-निषेधात्मक बाइसल्फाइट अनुक्रमण-आधारित दृष्टिकोणों का विकल्प प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल की पेशकश करके, जांचकर्ता रसायनों को जल्दी से स्क्रीन करने के लिए इस विधि का उपयोग कर सकते हैं और यह आकलन कर सकते हैं कि प्रारंभिक भ्रूण के विकास के दौरान 5-एमसी की बहुतायत कैसे प्रभावित हो सकती है। इसके अलावा, इस विधि का उपयोग एकाग्रता सीमा, विकास की अवधि और / या संवेदनशीलता की खिड़की की पहचान करने के लिए एक प्रीस्क्रीनिंग टूल के रूप में किया जा सकता है जिसमें ब्याज का रसायन 5-एमसी बहुतायत को प्रभावित करता है। वैकल्पिक रूप से, इस विधि का उपयोग एक अलग बायोमार्कर और एंटीबॉडी के लिए किया जा सकता है, हालांकि आगे अनुकूलन की आवश्यकता है। इस पद्धति का उपयोग करके, एक अन्वेषक जल्दी, कुशलतापूर्वक और लागत प्रभावी ढंग से एक रसायन की जांच और पहचान कर सकता है जो श्रम-गहन बाइसल्फाइट अनुक्रमण-आधारित दृष्टिकोणों में निवेश करने से पहले ज़ेब्राफिश भ्रूण के भीतर 5-एमसी की सापेक्ष बहुतायत को बदल देता है। हालांकि, यह विधि ज़ेबराफिश-विशिष्ट है, और यह निर्धारित करने के लिए आगे के शोध की आवश्यकता है कि क्या अन्य मॉडल जीवों के शुरुआती भ्रूण के भीतर सीटू में 5-एमसी का पता लगाया जा सकता है।

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि उनके पास कोई ज्ञात प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित या व्यक्तिगत संबंध नहीं हैं जो इस पेपर में रिपोर्ट किए गए काम को प्रभावित कर सकते हैं।

Acknowledgments

एसएबी को यूसीआर ग्रेजुएट डिवीजन फैलोशिप, एसएबी को एक एनआरएसए टी 32 प्रशिक्षण कार्यक्रम फैलोशिप (टी 32ईएस 018827), और डीसीवी को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान (आर01ईएस027576) और यूएसडीए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ फूड एंड एग्रीकल्चर हैच प्रोजेक्ट (1009609) द्वारा अनुसंधान सहायता प्रदान की गई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5-mL microcentrifuge tubes Fisher Scientific 540225
10-µL glass microcapillary pipette Fisher Scientific 211762B
100-mm plastic Petri dish Fisher Scientific 08757100D
10x phosphate-buffered saline  Fisher Scientific BP399500
1-mL pipette  Fisher Scientific 13690032
250-mL Erlenmeyer flask Fisher Scientific FB501250
5-mL pipette Fisher Scientific 13690033
60-mm glass petri dishes with lids Fisher Scientific 08747A
96-well plate Fisher Scientific 720089
AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody  Fisher Scientific A21121
Bovine serum albumin Fisher Scientific BP67110
DMSO Fisher Scientific BP2311
Hotplate  Fisher Scientific 1110016SH
In-tank breeding traps Aquatic Habitats N/A This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.  Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.
ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System Molecular Devices N/A Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.
Immunochemistry (IHC) basket N/A N/A Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.
MetaXpress 6.0.3.1658  Molecular Devices N/A Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.
Microspatula Fisher Scientific 2140115
Monoclonal mouse anti-5-mC antibody Millipore Sigma MABE146
NaOH Fisher Scientific BP359-500
Orbital shaker  Fisher Scientific 50998290
Parafilm  Fisher Scientific 1337412
Paraformaldehyde  Fisher Scientific 18612139
Plastic transfer pipette Fisher Scientific 1368050
Rstudio RStudio N/A RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.
Sheep serum Millipore Sigma S3772-5ML
Stereomicroscope Leica 10450103
Temperature-controlled incubator  Fisher Scientific PR505755L
Tween-20  Fisher Scientific P7949-500ML

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References

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विकासात्मक जीवविज्ञान अंक 186
बरकरार ज़ेबराफिश भ्रूण के भीतर सामान्य और असामान्य साइटोसिन मिथाइलेशन की त्वरित और कुशल स्थानिक निगरानी
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Avila-Barnard, S., Volz, D. C. Rapid … More

Avila-Barnard, S., Volz, D. C. Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (186), e64190, doi:10.3791/64190 (2022).

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