Summary
Questo articolo descrive un protocollo per il monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni intatti di zebrafish.
Abstract
La metilazione della citosina è altamente conservata tra le specie di vertebrati e, come fattore chiave della programmazione epigenetica e dello stato della cromatina, svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo embrionale precoce. Le modifiche enzimatiche guidano la metilazione attiva e la demetilazione della citosina in 5-metilcitosina (5-mC) e la successiva ossidazione di 5-mC in 5-idrossimetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carbossilcitosina. La riprogrammazione epigenetica è un periodo critico durante lo sviluppo in utero e l'esposizione materna a sostanze chimiche ha il potenziale per riprogrammare l'epigenoma all'interno della prole. Ciò può potenzialmente causare esiti avversi come conseguenze fenotipiche immediate, effetti a lungo termine sulla suscettibilità alle malattie negli adulti ed effetti transgenerazionali dei segni epigenetici ereditari. Sebbene il sequenziamento basato sulla bisolfito consenta ai ricercatori di interrogare la metilazione della citosina alla risoluzione della coppia di basi, gli approcci basati sul sequenziamento sono proibitivi in termini di costi e, come tali, precludono la capacità di monitorare la metilazione della citosina attraverso le fasi di sviluppo, concentrazioni multiple per sostanza chimica e replicare gli embrioni per trattamento. A causa della facilità dell'imaging automatizzato in vivo , delle manipolazioni genetiche, del rapido tempo di sviluppo ex utero e dell'allevamento durante l'embriogenesi, gli embrioni di zebrafish continuano ad essere utilizzati come modello fisiologicamente intatto per scoprire percorsi xenobiotici mediati che contribuiscono a esiti avversi durante lo sviluppo embrionale precoce. Pertanto, utilizzando anticorpi specifici per 5 mC disponibili in commercio, descriviamo una strategia economica per un monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina all'interno di singoli embrioni intatti di zebrafish sfruttando l'immunoistochimica a montaggio intero, l'imaging automatizzato ad alto contenuto e l'elaborazione efficiente dei dati utilizzando il linguaggio di programmazione prima dell'analisi statistica. Secondo le conoscenze attuali, questo metodo è il primo a rilevare e quantificare con successo i livelli di 5-mC in situ all'interno degli embrioni di zebrafish durante lo sviluppo iniziale. Il metodo consente la rilevazione della metilazione del DNA all'interno della massa cellulare e ha anche la capacità di rilevare la metilazione della citosina degli mRNA materni localizzati nel tuorlo durante la transizione da madre a zigotica. Nel complesso, questo metodo sarà utile per la rapida identificazione di sostanze chimiche che hanno il potenziale di interrompere la metilazione della citosina in situ durante la riprogrammazione epigenetica.
Introduction
Le modifiche enzimatiche guidano la metilazione attiva e la demetilazione della citosina in 5-metilcitosina (5-mC) e la successiva ossidazione di 5-mC in 5-idrossimetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carbossilcitosina 1,2. Il tris(1,3-dicloro-2-propil) fosfato (TDCIPP) è un ritardante di fiamma ampiamente utilizzato negli Stati Uniti che ha precedentemente dimostrato di alterare la traiettoria della metilazione della citosina dopo l'esposizione embrionale precoce da 0,75 ore dopo la fecondazione (hpf) fino alla gastrulazione precoce (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . All'interno dei vertebrati, il 5-mC e i suoi derivati modificati sono fondamentali per regolare lo sviluppo embrionale precoce9. La fecondazione di un embrione innesca la demetilazione del DNA parentale, seguita dalla degradazione dell'mRNA materno, dall'attivazione del genoma zigotico e dalla rimetilazione del genoma zigotico9. I processi biologicamente rilevanti che utilizzano la metilazione della citosina includono la modificazione degli istoni, il reclutamento del macchinario trascrizionale, la metilazione dell'RNA, la riprogrammazione epigenetica e la determinazione della struttura della cromatina10,11. La metilazione della citosina è conservata anche tra le specie di vertebrati, sottolineando l'importanza di comprendere e studiare come la metilazione aberrante della citosina possa influenzare la traiettoria di sviluppo di un organismo11. Inoltre, lo sviluppo in utero è sensibile all'esposizione materna e ha il potenziale di causare esiti avversi come conseguenze fenotipiche immediate, effetti a lungo termine sulla suscettibilità alle malattie negli adulti ed effetti transgenerazionali dei segni epigenetici ereditari12,13,14.
Lunghi tratti di coppie citosina-guanina, o isole CpG, sono stati i principali focolai dei ricercatori che mirano a caratterizzare la dinamica della metilazione della citosina attraverso il genoma15,16,17. Le strategie basate sul bisolfito come il sequenziamento del bisolfito dell'intero genoma, il sequenziamento del bisolfito a rappresentazione ridotta e il sequenziamento dell'amplicone del bisolfito rappresentano il gold standard per interrogare la metilazione della citosina alla risoluzione della coppia di basi. Tuttavia, gli approcci basati sul sequenziamento sono proibitivi in termini di costi e, in quanto tali, precludono la capacità di monitorare la metilazione della citosina attraverso le fasi di sviluppo, concentrazioni multiple per sostanza chimica e replicare gli embrioni per trattamento. Inoltre, gli approcci basati sul sequenziamento non forniscono informazioni sulla localizzazione spaziale, che è fondamentale per comprendere i tipi di cellule potenzialmente interessate e le aree all'interno di un embrione in via di sviluppo. Allo stesso modo, i saggi globali di metilazione del DNA come l'analisi di restrizione dipendente dalla metilazione, i saggi immunologici legati all'enzima 5-mC (ELISA) e la cromatografia-spettrometria di massa liquida (LC-MS) 5-metil-2'-deossicitidina (5-mC) si basano su omogenati cellulari o tissutali e, come tali, precludono la capacità di monitorare la localizzazione e l'entità della metilazione della citosina nello spazio e nel tempo all'interno di campioni intatti12,18.
A causa della facilità dell'imaging automatizzato in vivo , delle manipolazioni genetiche, del rapido tempo di sviluppo ex utero e dell'allevamento durante l'embriogenesi, gli embrioni di zebrafish continuano ad essere ampiamente utilizzati come modelli fisiologicamente intatti per scoprire percorsi mediati da xenobiotici che contribuiscono a esiti avversi durante lo sviluppo embrionale precoce. Pertanto, utilizzando anticorpi disponibili in commercio specifici per 5-mC, il protocollo seguente descrive una strategia economica per un monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina all'interno di singoli embrioni intatti di zebrafish sfruttando l'immunoistochimica a montaggio intero (IHC), l'imaging automatizzato ad alto contenuto e l'elaborazione efficiente dei dati utilizzando il linguaggio di programmazione prima dell'analisi statistica.
Secondo le conoscenze attuali, questo metodo è il primo a monitorare 5-mC all'interno di embrioni di zebrafish intatti. Il metodo consente la rilevazione della metilazione del DNA all'interno della massa cellulare e ha anche la capacità di rilevare la metilazione della citosina degli mRNA materni localizzati nel tuorlo durante la transizione da madre a zigotica. Nel complesso, questo metodo sarà utile per la rapida identificazione di sostanze chimiche che hanno il potenziale di interrompere la metilazione della citosina in situ durante la riprogrammazione epigenetica.
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Protocol
Gli allevatori adulti sono stati gestiti e trattati in conformità con un protocollo di utilizzo degli animali approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (# 20180063) presso l'Università della California, Riverside.
1. Raccolta di embrioni di zebrafish ed esposizione chimica
- Aggiungi trappole da riproduzione in vasca alle vasche contenenti pesci zebra maschi e femmine adulti sessualmente maturi e riproduttivamente vitali. Aggiungere almeno tre trappole per serbatoio da 6 litri almeno 12 ore prima della raccolta a ~ 9:00 AM, che è il tempo approssimativo di fecondazione e deposizione delle uova all'interno dei serbatoi.
- Preparare una nuova soluzione di esposizione la mattina della raccolta. La soluzione di esposizione viene preparata utilizzando una pipetta da 5 ml e aggiungendo 5,0 ml di acqua di sistema priva di particelle a una capsula di Petri di vetro da 60 mm.
- Quindi, utilizzare una pipetta microcapillare di vetro da 10 μL per trasferire 10 μL di veicolo (dimetilsolfossido, o DMSO) o soluzione madre chimica all'acqua di sistema nel piatto di vetro.
- Ruotare la capsula di Petri di vetro per assicurarsi che la soluzione madre si dissolva. Aggiungere altri 5,0 ml di acqua di sistema alla capsula di Petri di vetro. Ruotare la capsula di Petri di vetro per omogeneizzare la soluzione di esposizione.
- Ripetere l'operazione per ciascun gruppo di trattamento in repliche di quattro per ottenere quattro repliche per trattamento.
- Dopo aver preparato le soluzioni di esposizione, tappare le stoviglie di vetro con coperchi di vetro per ridurre al minimo l'evaporazione.
- Durante la rimozione delle trappole di allevamento da ciascun serbatoio, lasciare con attenzione che l'acqua all'interno di ciascuna trappola defluisca nel serbatoio prima di rimuoverla dai serbatoi. Assicurati che le trappole rimangano sul lato destro verso l'alto.
- Trasferire le trappole di riproduzione nel lavandino del laboratorio e sciacquarle usando una bottiglia di spruzzo riempita con acqua di osmosi inversa (RO) in una rete da pesca precedentemente imbevuta di candeggina al 10% e risciacquata con acqua. Risciacquare gli embrioni fino a quando tutti i detriti sono stati eliminati e rimangono solo embrioni puliti.
- Trasferire gli embrioni dalla rete da pesca utilizzando una bottiglia di spruzzo riempita d'acqua RO in una capsula di Petri di plastica da 100 mm. Ordinare in modo casuale 50 embrioni vivi a 0,75 ore dopo la fecondazione (hpf) e rimuovere l'acqua RO in eccesso.
- Utilizzando una microspatola, inserire gli embrioni ordinati nella soluzione di trattamento. Tutti gli embrioni devono trovarsi all'interno del veicolo o della soluzione di trattamento non prima delle 9:45. Ruotare i piatti di vetro per assicurarsi che gli embrioni siano uniformemente rivestiti all'interno della soluzione di trattamento.
- Dopo aver impostato quattro piatti replicati (N = 50 per replica) per ciascun gruppo di trattamento, posizionare il coperchio di vetro sopra i piatti esposti e trasferire tutti i piatti in un incubatore a temperatura controllata impostato a 28 °C fino a 2 hpf, 4 hpf, 6hpf, 8 hpf o 10 hpf.
- Preparare paraformaldeide fresca al 4% (PFA) almeno 4 ore prima della fine dell'esposizione e conservare a 4 °C.
- Accendere la piastra riscaldante a 115 °C, produrre 20 ml di 1x soluzione salina tamponata fosfato (PBS) (2 ml di 10x PBS + 18 ml di acqua RO) in una provetta da centrifuga da 50 ml e pesare 800 mg di paraformaldeide.
- All'interno di una cappa chimica, trasferire 1x soluzione PBS in un matraccio Erlenmeyer da 250 ml, aggiungere 800 mg di paraformaldeide e quindi aggiungere 2 μL di NaOH 10 N. Posizionare un termometro all'interno del pallone, posizionare il pallone sulla piastra riscaldante e osservare la temperatura mentre si mescola.
- Quando la temperatura raggiunge 62-65 °Crimuovere il 4% di PFA dalla piastra riscaldante e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente (RT). Conservare il PFA al 4% a 4 °C.
- Una volta terminata la durata dell'esposizione, rimuovere gli embrioni dall'incubatrice e trasferire tutti gli embrioni viventi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Aspirare la soluzione di esposizione residua utilizzando una pipetta da 1 ml. Non aspirare embrioni.
- Aggiungere 500 μL di PFA refrigerato al 4% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e mescolare gli embrioni in PFA al 4% capovolgendo più volte. Lasciare che gli embrioni si fissino in PFA al 4% durante la notte.
NOTA: Non è consigliabile consentire agli embrioni di rimanere in PFA per più di 12 ore.
2. Dechorionazione degli embrioni
- Il giorno seguente, aspirare il PFA al 4%, risospendere gli embrioni in 1x PBS e pipettare delicatamente su e giù per 30 s. Se necessario, interrompere il protocollo in questa fase e conservare gli embrioni in 1x PBS a 4 °C per un massimo di 48 ore.
- Utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica, trasferire con cura gli embrioni fissi in una piastra di vetro riempita d'acqua RO e ruotare delicatamente per 30 s. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
- Utilizzare aghi per siringhe con ingrandimento 5,0x utilizzando uno stereomicroscopio standard per dechorionare manualmente tutti gli embrioni. Fallo usando la punta dell'ago per perforare il corion e staccarlo delicatamente dal tuorlo e dalla massa cellulare4.
- Una volta che gli embrioni sono stati dechorionati, utilizzare una pipetta microcapillare di vetro per trasferire fino a 25 embrioni intatti in un cesto di immunochimica (IHC) e posizionare il cestello IHC in una piastra da 96 pozzetti. Utilizzare una pipetta da 1 mL per aspirare l'acqua RO da ciascun pozzetto.
3. Immunoistochimica con anticorpi specifici per 5-mC
- Risospendere gli embrioni in 500 μL di tampone bloccante (1x PBST + 2% siero di pecora + 2 mg/ml di albumina sierica bovina) per pozzetto e avvolgere la piastra con parafilm e foglio di alluminio per proteggerli dalla luce. Incubare a 4 °C per 4 ore su uno shaker orbitale (100 rpm).
- Rimuovere l'involucro del parafilm e l'alluminio e utilizzare una pipetta da 1 mL per aspirare il tampone di blocco da ciascun pozzetto. Sostituirlo con 500 μL di una diluizione 1:100 di anticorpo monoclonale di topo anti-5-mC nel tampone di blocco. Incubare tutti gli embrioni con anticorpi primari ad eccezione di un sottogruppo di embrioni di controllo del veicolo che saranno incubati con il tampone di blocco per tenere conto del rumore di fondo. Fare attenzione a non interrompere l'integrità degli embrioni, né ad aspirare gli embrioni durante questa fase.
- Riavvolgere la piastra in parafilm e foglio di alluminio e lasciare che la piastra incubi a 4 °C durante la notte su uno shaker orbitale (100 rpm).
- Il giorno seguente, rimuovere la soluzione anticorpale primaria da ciascun pozzetto e sostituirla con 1x PBS + 0,1% Tween-20 (1x PBST). Lavare ogni pozzetto tre volte con 1x PBST per 15 minuti per lavaggio su uno shaker orbitale (100 rpm).
- Sostituire 1x PBST con una diluizione 1:500 di anticorpo IgG anti-topo di capra nel tampone bloccante e incubare tutti gli embrioni con l'anticorpo secondario. Lasciare incubare la piastra a 4 °C durante la notte su uno shaker orbitale (100 rpm).
- Il giorno seguente, rimuovere l'anticorpo secondario e lavare la soluzione residua tre volte con 1x PBST per 15 minuti per lavaggio su uno shaker orbitale (100 rpm).
NOTA: Il protocollo può essere interrotto qui per un massimo di 48 ore se i cestelli IHC sono conservati in pozzi puliti riempiti con 1x PBS. - Utilizzare una pipetta da 1 mL per aspirare 1x PBST da ciascun pozzetto e posizionare il cestello IHC in una capsula di Petri di vetro riempita con acqua RO. Sotto uno stereomicroscopio standard, ordinare casualmente embrioni intatti in una piastra da 96 pozzetti, ottenendo un embrione per pozzetto.
- Utilizzando una pipetta da 1 ml, rimuovere tutta l'acqua RO dai singoli pozzetti e sostituirla con 200 μL di 1x PBS. Centrifugare la piastra per 3 minuti a 1 x g.
4. Imaging automatizzato di embrioni all'interno di piastre a 96 pozzetti
- Immagina gli embrioni con un obiettivo 2x sotto luce trasmessa e FITC utilizzando un sistema di screening ad alto contenuto (Table of Materials).
NOTA: Un'immagine fluorescente di ciascun embrione è stata catturata automaticamente utilizzando l'ingrandimento sopra menzionato e un filtro FITC19.- Selezionare Autofocus per assicurarsi che la messa a fuoco della fotocamera sia sul fondo della piastra e sfalsata dallo spessore inferiore.
- Selezionare una lunghezza d'onda FITC con una durata di esposizione di 100 ms e impostare l'autofocus su laser con offset Z. Osservare e confermare la corretta acquisizione dell'immagine in diversi pozzetti prima di iniziare l'acquisizione della piastra.
NOTA: Lo strumento acquisisce automaticamente le immagini da tutti i pozzetti selezionati contenenti embrioni. Una piastra da 96 pozzetti richiedeva circa 30 minuti per l'acquisizione delle immagini e l'archiviazione dei dati. Per tutta la durata del periodo di acquisizione, la temperatura interna all'interno del sistema di imaging è stata mantenuta a RT.
- Dopo l'acquisizione delle immagini, eseguire l'analisi dei dati utilizzando il sistema di screening ad alto contenuto e una procedura di analisi delle immagini automatizzata personalizzata. Selezionare ogni embrione sulla piastra a 96 pozzetti da analizzare per l'area totale e l'intensità integrata della fluorescenza.
NOTA: l'analisi includeva la fornitura di immagini contenenti sovrapposizioni di punti dati dell'analisi. - Quindi, tabulare i punti dati ed esportarli dal sistema di screening ad alto contenuto andando sotto Misura e selezionando Apri registro dati in un foglio di calcolo. Le parti di acquisizione delle lastre e di analisi dei dati sono illustrate nella Figura 1.
5. Analisi dei dati
- Caricare il foglio di calcolo esportato in un programma per computer in cui il pacchetto deployer (dplyr) viene utilizzato per ordinare, sommare i dati per ciascun pozzetto e filtrare in base al numero di pozzo. Il pacchetto writexl viene quindi utilizzato per esportare i dati riepilogati in un foglio di calcolo. Il codice del programma 5mC è mostrato nel file supplementare 1.
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Representative Results
Lo scopo generale di questo protocollo è determinare se un trattamento influisce sull'abbondanza relativa di 5-mC valutando l'area totale e l'intensità relativa della fluorescenza all'interno di embrioni di zebrafish fissi ed etichettati. Dopo aver completato il protocollo, è possibile utilizzare uno stereomicroscopio a fluorescenza per determinare innanzitutto se l'IHC a montaggio completo ha avuto successo. Quando gli embrioni marcati sono osservati sotto un filtro FITC o GFP, un risultato positivo è indicato da un segnale FITC positivo all'interno dell'embrione, mentre un risultato negativo è indicato dall'assenza di fluorescenza all'interno degli embrioni di controllo. Utilizzando un sistema di screening ad alto contenuto, questi risultati possono essere confermati anche durante l'acquisizione delle immagini utilizzando un filtro FITC. Inoltre, durante l'analisi dei dati, il modulo personalizzato identificherà e quantificherà l'area totale e l'intensità integrata della fluorescenza. Le immagini rappresentative dei risultati positivi sono mostrate nella Figura 1, dove le immagini acquisite sono state misurate con successo dal modulo personalizzato e i singoli punti dati (mostrati come sovrapposizione blu) sono stati acquisiti sia per l'area totale che per l'intensità integrata.
Durante l'estrazione dei dati, il rigore di soglia all'interno del modulo personalizzato è una variabile aggiuntiva che deve essere ottimizzata per massimizzare il rapporto segnale-rumore e aumentare la probabilità di rilevare una differenza significativa specifica del trattamento nell'abbondanza di 5 mC. Durante l'ottimizzazione, questa soglia finale ha fornito la separazione più significativa tra le mediane dei gruppi di controllo e di trattamento (ad esempio, il più grande rapporto segnale-rumore). I risultati rappresentativi a diverse soglie di moduli personalizzati che influiscono sui rapporti segnale/rumore sono presentati nella Figura 2.
Figura 1: Un diagramma di flusso che fornisce una rappresentazione grafica del protocollo per l'esposizione e la rilevazione in situ della 5-metilcitosina per 6 embrioni di zebrafish hpf. La direzione del diagramma di flusso è fornita con frecce nere. Le esposizioni si sono verificate in repliche di quattro piatti replicati per trattamento e 50 embrioni per piatto replicato. Abbreviazioni: cm = massa cellulare; ys = sacco vitellino. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Ottimizzazione del modulo personalizzato. I pannelli A-D mostrano l'ottimizzazione del modulo personalizzato valutando la mediana e la distribuzione dell'area totale specifica di 5 mC e l'intensità integrata all'interno degli embrioni di zebrafish a 6 hpf. (A,B) Le diverse soglie testate sono elencate nella legenda a destra (differenza di 100 tra ciascuna soglia) e sono ordinate per rigore, dove 1500 e 2500 rappresentano rispettivamente le soglie meno e più rigorose testate. (C,D) Le diverse soglie testate sono elencate nella legenda a destra (differenza di 250 tra ciascuna soglia) e ordinate per rigore, dove 1500 e 2500 rappresentano rispettivamente le soglie meno e più rigorose testate. Il (*) in C,D indica soglie che sono significativamente diverse dagli embrioni trattati con veicolo (p < 0,05). Per A,B, tutte le soglie testate erano significative dal controllo del veicolo. L'asse x indica l'esposizione a entrambi i veicoli (0,1% DMSO) o 0,78 μM TDCIPP (controllo positivo). L'asse y indica la fluorescenza relativa. Il pannello A mostra l'area totale di 5-mC rilevata all'interno degli embrioni in funzione del trattamento, mentre il pannello B mostra l'intensità integrata di 5-mC all'interno della stessa area. Un embrione è rappresentato da un singolo punto dati per un totale di N = 96 per ciascun gruppo di trattamento. Tutte le esposizioni sono state eseguite in repliche di quattro piatti per trattamento con 50 embrioni per piatto di vetro. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
File supplementare 1: codice programma 5mC. Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
Durante questo protocollo, ci sono alcuni passaggi che sono critici. In primo luogo, quando si dechorionano gli embrioni, è importante puntare l'ago lontano dal tessuto dell'embrione / sacco vitellino / massa cellulare, poiché queste porzioni dell'embrione in via di sviluppo sono molto fragili e facili da perforare. In secondo luogo, quando si trasferiscono embrioni marcati a singoli pozzetti, utilizzare una pipetta di vetro per trasferire gli embrioni in quanto aderiranno a una pipetta di plastica. In terzo luogo, quando si esegue IHC a montaggio completo, assicurarsi che la piastra sia protetta dalla luce. Infine, dopo aver completato il protocollo IHC a montaggio completo, lasciare che la piastra incubi in 1x PBS a 4 °C durante la notte prima dell'imaging, in quanto ciò ridurrà al minimo l'autofluorescenza che potrebbe interferire con l'imaging.
Se ci sono embrioni che sono stati recisi durante la dechorionation o IHC, escludere questi embrioni dal resto del protocollo. Se non viene rilevata fluorescenza, questo può essere risolto incubando più a lungo (fino a 16 ore). Poiché si tratta di un anticorpo specifico per 5 mC, sia il DNA che l'RNA possono essere marcati. Una comprensione generale della localizzazione spaziale è importante.
Ci sono alcune limitazioni in questo metodo. In primo luogo, è una tecnica non mirata, il che significa che non fornirà la quantità esatta di 5-mC, ma piuttosto l'abbondanza relativa in base all'area totale e all'intensità integrata della fluorescenza. Inoltre, questo protocollo è stato testato solo sugli embrioni prima della segmentazione, quindi se si testano fasi successive di sviluppo, potrebbe essere necessaria un'ulteriore ottimizzazione. Inoltre, poiché il metodo è basato su IHC, può essere suscettibile di legame non specifico; pertanto, non è certo che si stia colorando solo 5-mC localizzati nel DNA, ma potrebbe anche colorare 5-mC localizzati in RNA. Infine, potrebbe essere necessaria un'ottimizzazione della soglia di analisi dei dati a seconda della sostanza chimica e del rigore delle condizioni preferite.
Nel complesso, questo metodo fornisce un rilevamento rapido ed economico di 5-mC in più fasi di sviluppo e concentrazioni chimiche3. Fornisce quindi un'alternativa agli approcci basati sul sequenziamento del bisolfito proibitivi in termini di costi. Offrendo questo protocollo, i ricercatori possono utilizzare questo metodo per esaminare rapidamente le sostanze chimiche e valutare come l'abbondanza di 5-mC può essere influenzata durante lo sviluppo embrionale precoce. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato come strumento di prescreening per identificare l'intervallo di concentrazione, il periodo di sviluppo e / o la finestra di sensibilità in cui la sostanza chimica di interesse influenza l'abbondanza di 5-mC. In alternativa, questo stesso metodo può essere utilizzato per un diverso biomarcatore e anticorpo, anche se è necessaria un'ulteriore ottimizzazione. Utilizzando questo metodo, un ricercatore può esaminare e identificare in modo rapido, efficiente ed economico una sostanza chimica che altera l'abbondanza relativa di 5 mC all'interno degli embrioni di zebrafish prima di investire in approcci basati sul sequenziamento del bisolfito ad alta intensità di lavoro. Tuttavia, questo metodo è specifico per il pesce zebra e sono necessarie ulteriori ricerche per determinare se 5-mC può essere rilevato in situ all'interno di embrioni precoci di altri organismi modello.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti noti o relazioni personali che potrebbero aver influenzato il lavoro riportato in questo articolo.
Acknowledgments
Il supporto alla ricerca è stato fornito da una UCR Graduate Division Fellowship a SAB, una NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) a SAB e una sovvenzione del National Institutes of Health (R01ES027576) e USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) a DCV.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5-mL microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 540225 | |
| 10-µL glass microcapillary pipette | Fisher Scientific | 211762B | |
| 100-mm plastic Petri dish | Fisher Scientific | 08757100D | |
| 10x phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP399500 | |
| 1-mL pipette | Fisher Scientific | 13690032 | |
| 250-mL Erlenmeyer flask | Fisher Scientific | FB501250 | |
| 5-mL pipette | Fisher Scientific | 13690033 | |
| 60-mm glass petri dishes with lids | Fisher Scientific | 08747A | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 720089 | |
| AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody | Fisher Scientific | A21121 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP67110 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP2311 | |
| Hotplate | Fisher Scientific | 1110016SH | |
| In-tank breeding traps | Aquatic Habitats | N/A | This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair. Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors. |
| ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System | Molecular Devices | N/A | Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable. |
| Immunochemistry (IHC) basket | N/A | N/A | Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates. |
| MetaXpress 6.0.3.1658 | Molecular Devices | N/A | Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable. |
| Microspatula | Fisher Scientific | 2140115 | |
| Monoclonal mouse anti-5-mC antibody | Millipore Sigma | MABE146 | |
| NaOH | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Orbital shaker | Fisher Scientific | 50998290 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 1337412 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | 18612139 | |
| Plastic transfer pipette | Fisher Scientific | 1368050 | |
| Rstudio | RStudio | N/A | RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com. |
| Sheep serum | Millipore Sigma | S3772-5ML | |
| Stereomicroscope | Leica | 10450103 | |
| Temperature-controlled incubator | Fisher Scientific | PR505755L | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | P7949-500ML |
References
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