ヒト幹細胞移植および検証のための ex vivo モデルとしての成体ヒト皮質の有機型培養
Summary
このプロトコルは、人工多能性幹細胞由来の皮質前駆細胞の ex vivo 皮質内移植と組み合わせた成人ヒト皮質の長期器官型培養を説明しており、ヒト神経変性疾患に対する幹細胞ベースの治療法をさらにテストするための新しい方法論を提示します。
Abstract
神経変性疾患は、その症状と細胞の影響の点で一般的で不均一であり、人間の病気を完全に模倣する適切な動物モデルがなく、死後の人間の脳組織の入手可能性が悪いため、研究が複雑になっています。成人のヒト神経組織培養は、神経障害のさまざまな側面を研究する可能性を提供します。分子、細胞、および生化学的メカニズムは、このシステムで簡単に対処できるだけでなく、薬物や細胞ベースの治療法などのさまざまな治療法をテストおよび検証することもできます。この方法は、切除手術を受けているてんかん患者から得られた成人ヒト皮質の長期器官型培養と、人工多能性幹細胞由来の皮質前駆細胞の ex vivo 皮質内移植を組み合わせたものです。この方法は、細胞の生存、神経分化、シナプス入出力の形成、および無傷の成人ヒト皮質組織への移植後のヒト由来細胞の電気生理学的特性の研究を可能にします。このアプローチは、さまざまな神経障害を持つ患者のための幹細胞ベースの治療法の臨床翻訳に基礎研究を近づけ、損傷した神経回路を再構築するための新しいツールの開発を可能にする3Dヒト疾患モデリングプラットフォームの開発前の重要なステップです。
Introduction
パーキンソン病、アルツハイマー病、虚血性脳卒中などの神経変性疾患は、神経機能不全または死の共通の特徴を共有する疾患のグループです。それらは、影響を受ける脳領域とニューロン集団の点で不均一です。残念ながら、これらの疾患の治療法は、人間の脳で起こることを模倣する動物モデルがないため、乏しいか、有効性が限られています1,2。幹細胞治療は、脳再生のための最も有望な戦略の1つです3。異なる供給源からの幹細胞からのニューロン前駆細胞の生成は、近年大きく開発されている4,5。最近の発表によると、ヒト人工多能性幹(iPS)細胞由来の長期自己複製神経上皮様幹(lt-NES)細胞は、皮質分化プロトコルに従い、体性感覚皮質に影響を与える虚血性脳卒中のラットモデルで皮質内移植後に成熟皮質ニューロンを生成します。さらに、移植片由来のニューロンは、宿主ニューロンから求心性および遠心性シナプス接続を受け取り、ラットニューロンネットワークへのそれらの統合を示す6,7。移植片由来の軸索は有髄であり、梗塞周囲領域、脳梁、および対側体性感覚皮質を含むラット脳のさまざまな領域に見られました。最も重要なことは、iPS細胞由来移植が脳卒中動物の運動障害を逆転させたことです7。
動物モデルが移植生存、神経細胞統合、および運動および認知機能に対する移植細胞の影響の研究に役立つとしても、ヒト細胞(移植片宿主)間の相互作用に関する情報はこのシステムでは欠落しています8,9。このため、ヒトiPS細胞由来神経前駆細胞のex vivo移植とヒト脳器官型培養の長期併用法について述べる。脳神経外科的切除から得られたヒト脳器官型培養は、生理学的に関連する脳の3Dモデルであり、研究者はヒトの中枢神経系回路とヒト脳障害の治療をテストする最も正確な方法の理解を深めることができます。しかし、この文脈では十分な研究が行われておらず、ほとんどの場合、ヒト海馬脳器官型培養が使用されています10,11。大脳皮質は、虚血性脳卒中12やアルツハイマー病13などのいくつかの神経変性疾患の影響を受けているため、知識を拡大し、さまざまな治療戦略をテストおよび検証できる人間の皮質3Dシステムを持つことが重要です。過去数年間のいくつかの研究では、成人のヒト皮質(hACtx)組織からの培養を使用して、ヒトの脳疾患をモデル化しています14,15,16,17,18,19;ただし、幹細胞治療のコンテキストで利用できる情報は限られています。2つの研究は、ここで説明するシステムの実現可能性をすでに実証しています。2018年、異なる転写因子でプログラムされ、hACtx組織に移植されたヒト胚性幹細胞は、成人のヒト皮質ネットワークに統合できる成熟皮質ニューロンを生じさせることが示された20。2020年、lt-NES細胞のヒト器官型システムへの移植により、機能ニューロンの電気生理学的特性を備えた成熟した層特異的皮質ニューロンに分化する能力が明らかになりました。移植されたニューロンは、狂犬病ウイルス逆行性単シナプス追跡、全細胞パッチクランプ記録、および免疫電子顕微鏡検査によって裏付けられるように、成人脳スライスのヒト皮質ニューロンとの求心性および遠心性シナプス接触の両方を確立しました21。
Protocol
このプロトコルは、スウェーデンのルンドにある地域倫理委員会によって承認されたガイドライン(倫理許可番号2021-07006-01)に従います。健康な新皮質組織は、側頭葉てんかんの待機的手術を受けている患者から得られました。すべての患者からインフォームドコンセントが得られた。 注:得られたすべての組織は、サイズに関係なく処理されました。ただし、サイズが1〜…
Representative Results
記載されたプロトコールに従って、側頭葉てんかんを有する患者からのhACtx組織を、上記で説明したように収集し、処理した。数枚のスライスを培養24時間後に固定し、宿主組織の開始点を調べた。ニューロン(NeuNおよびMap2を発現、図1A)、希突起膠細胞(Olig2およびMBP、図1B)、およびアストロサイト(ヒト特異的GFAP、STEM123とも呼ばれる、図1C)などのさ…
Discussion
十分に高品質のhACtxスライスを取得することは、このプロトコルの最も重要なステップです。 皮質組織は、切除手術を受けているてんかん患者から得られる24。切除された組織の質、および切除と培養の間の組織の曝露時間は重要です。組織が手術室から実験室に移されて切断される速度が速いほど、有機型培養はより最適になります。理想的には、組織を切断…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、スウェーデン研究評議会、スウェーデン脳財団、スウェーデン脳卒中財団、スコーネ地域、トルステンおよびエルザセゲルファルク財団、およびスウェーデン政府戦略研究分野イニシアチブ(StemTherapy)からの助成金によってサポートされています。
Materials
| Tissue Cutting and electrophysiology | |||
| Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt | Sigma | A9187 | |
| Bath temperature controller | Luigs & Neumann | TC0511354 | |
| Calcium Chloride dihydrate | Merck | 102382 | |
| Carbogen gas | Air Liquide | NA | |
| Cooler | Julaba FL 300 | 9661012.03 | |
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Double Patch-Clamp amplifier | HEKA electronic | EPC10 | |
| Guanosine 5'-Triphosphate disodium salt | Millipore | 371701 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Magnesium Sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| Patchmaster | HEKA electronic | Patchmaster 2×91 | |
| Pipette Puller | Sutter | P-2000 | |
| Plastic Petri dish | Any suitable | ||
| Potassium chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium D-gluconate | ThermoFisher | B25135 | |
| Rubber teat + glass pipette | Any suitable | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Merck | 106346 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | |
| Tissue adhesive: Acryl super glue | Loctite | 2062278 | |
| Upright microscope | Olympus | BX51WI | |
| Vibratome | Leica | VT1200 S | |
| RINSING SOLUTION | |||
| D-(+)Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HBSS (without Ca, Mg, or PhenolRed) | ThermoFisher Scientific | 14175095 | |
| HEPES | AppliChem | A1069 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15-140-122 | |
| MANTAINANCE AND CULTURE OF HUMAN NEOCORTICAL TISSUE | |||
| 6-well plate | ThermoFisher Scientific | 140675 | |
| Alvetex scaffold 6 well insert | Reinnervate Ltd | AVP004-96 | |
| B27 Supplement (50x) | ThermoFisher Scientific | 17504001 | |
| BrainPhys without Phenol Red | StemCell technologies | #05791 | Referenced as neuronal medium in the text |
| Filter units 250 mL or 500 mL | Corning Sigma | CLS431096/97 | |
| Forceps | Any suitable | ||
| Gentamicin (50 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 15750037 | |
| Glutamax Supplement (100x) | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Referenced as L-glutamine in the text |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable | ||
| GENERATION OF lt-NES cells | |||
| 2-Mercaptoethanol 50 mM | ThermoFisher Scientific | 31350010 | |
| Animal Free Recombinant EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 Suplemment (50x) | Thermo Fisher Scientific | 17504001 | |
| bFGF | Peprotech | AF-100-18B | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | ThermoFisher Scientific | 15260037 | |
| Cyclopamine, V. calcifornicum | Calbiochem | # 239803 | |
| D (+) Glucose solution (45%) | Sigma | G8769 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2438-10mL | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320074 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline (DPBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190-144 | Without calcium and magnesium |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
| MEM Non-essential aminoacids solutions (100x) | ThermoFisher Scientific | 11140050 | |
| N-2 Supplement (100 x) | ThermoFisher Scientific | 17502001 | |
| Poly-L-Ornithine | Merk | P3655 | |
| Recombinant Human BMP-4 Protein | R&D Systems | 314-BP-010 | |
| Recombinant Human Wnt-3a Protein | R&D Systems | 5036-WN | |
| Sodium Pyruvate (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360070 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor, powder | Thermo Fisher Scientific | 17075029 | |
| Sterile deionized water | MilliQ | MilliQ filter system | |
| Trypsin EDTA (0.25%) | Sigma | T4049-500ML | |
| EQUIPMENT FOR CELL CULTURE | |||
| Adjustable volume pipettes 10, 100, 200, 1000 µL | Eppendorf | Various | |
| Basement membrane matrix ESC-qualified (Matrigel) | Corning | CLS354277-1EA | |
| Centrifuge | Hettich Centrifugen | Rotina 420R | 5% CO2, 37 °C |
| Incubator | ThermoForma Steri-Cult CO2 | HEPA Class100 | |
| Stem cell cutting tool 0.190-0.210 mm | Vitrolife | 14601 | |
| Sterile tubes | Sarstedt | Various | |
| Sterile Disposable Glass Pasteur Pipettes 150 mm | VWR | 612-1701 | |
| Sterile pipette tips 0.1-1000 µL | Biotix VWR | Various | |
| Sterile Serological Pipettes 5, 10, 25, 50 mL | Costar | Various | |
| T25 flasks Nunc | ThermoFisher Scientific | 156367 | |
| IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-545-151 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-rabbit IgG | Jackson ImmunoReserach | 711-545-152 | |
| 488-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-545-155 | |
| Alexa fluor 647-conjugated Streptavidin | Jackson ImmunoReserach | 016-600-084 | |
| Bovine Serum Albumin | Jackson ImmunoReserach | 001-000-162 | |
| Chicken anti-GFP | Merk Millipore | AB16901 | |
| Chicken anti-MAP2 | Abcam | ab5392 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-chicken IgG | Jackson ImmunoReserach | 703-165-155 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-goat IgG | Jackson ImmunoReserach | 705-165-147 | |
| Cy3-conjugated AffinityPure Donkey anti-mouse IgG | Jackson ImmunoReserach | 715-165-151 | |
| Diazabicyclooctane (DABCO) | Sigma Aldrich | D27802 | Mounting media |
| Goat anti-AIF1 (C-terminal) | Biorad | AHP2024 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | Nuclear staining | |
| Mouse anti-MBP | BioLegend | 808402 | |
| Mouse anti-SC123 | Stem Cells Inc | AB-123-U-050 | |
| Normal Donkey Serum | Merk Millipore | S30-100 | |
| Paint brush | Any suitable | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | 150127 | |
| Potassium Phospate Buffer Saline, KPBS (1x) | |||
| Distilled water | |||
| Potassium dihydrogen Phospate (KH2PO4) | Merk Millipore | 104873 | |
| Potassium phospate dibasic (K2HPO4) | Sigma Aldrich | P3786 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Rabbit anti-NeuN | Abcam | ab104225 | |
| Rabbit anti-Olig2 | Abcam | ab109186 | |
| Rabbit anti-TMEM119 | Abcam | ab185333 | |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002-5G | |
| Sodium citrate | |||
| Distilled water | |||
| Tri-Sodium Citrate | Sigma Aldrich | S1804-500G | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379 | |
| Triton X-100 | ThermoFisher Scientific | 327371000 | |
| EQUIPMENT FOR IMMUNOHISTOCHEMISTRY | |||
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| Microscope Slides 76 mm x 26 mm | VWR | 630-1985 | |
| Microscope Coverslips 24 mm x 60 mm | Marienfeld | 107242 | |
| Microscope Software | Zeiss | ZEN Black edition | |
| Rubber teat + Glass pipette | Any suitable |
References
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Cite This Article
Palma-Tortosa, S., Martínez-Curiel, R., Aretio-Medina, C., Avaliani, N., Kokaia, Z. Organotypic Cultures of Adult Human Cortex as an Ex vivo Model for Human Stem Cell Transplantation and Validation. J. Vis. Exp. (190), e64234, doi:10.3791/64234 (2022).