Бесклеточный синтез белка из экзонуклеазно-дефицитных клеточных экстрактов с использованием линейных шаблонов ДНК
Summary
Здесь представлен протокол получения и буферной калибровки клеточных экстрактов из нокаутирующих штаммов экзонуклеазы V Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD и ΔrecB). Это быстрый, простой и прямой подход к экспрессии в бесклеточных системах синтеза белка с использованием линейных шаблонов ДНК.
Abstract
Бесклеточный синтез белка (CFPS) в последнее время стал очень популярным в области синтетической биологии благодаря своим многочисленным преимуществам. Использование линейных шаблонов ДНК для CFPS позволит технологии достичь своего полного потенциала, уменьшая время эксперимента за счет устранения этапов клонирования, трансформации и экстракции плазмид. Линейная ДНК может быть быстро и легко амплифицирована с помощью ПЦР для получения высоких концентраций шаблона, избегая потенциальной токсичности экспрессии in vivo . Однако линейные шаблоны ДНК быстро разлагаются экзонуклеазами, которые естественным образом присутствуют в клеточных экстрактах. Существует несколько стратегий, которые были предложены для решения этой проблемы, такие как добавление ингибиторов нуклеазы или химическая модификация линейных концов ДНК для защиты. Все эти стратегии стоят дополнительного времени и ресурсов и еще не достигли почти плазмидных уровней экспрессии белка. Подробный протокол для альтернативной стратегии представлен здесь для использования линейных шаблонов ДНК для CFPS. Используя клеточные экстракты из нокаут-клеток с дефицитом экзонуклеазы, линейные шаблоны ДНК остаются нетронутыми, не требуя каких-либо конечных модификаций. Представлены этапы получения клеточного лизата из штамма Escherichia coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD методом лизиса ультразвуком и калибровки буфера для Mg-глутамата (Mg-glu) и K-глутамата (K-glu) специально для линейной ДНК. Этот метод способен достичь уровней экспрессии белка, сопоставимых с уровнями плазмидной ДНК в CFPS E. coli .
Introduction
Системы бесклеточного синтеза белка (CFPS) все чаще используются в качестве быстрого, простого и эффективного метода для биосенсорной инженерии, децентрализованного производства и прототипирования генетических схем1. Благодаря своему большому потенциалу, системы CFPS регулярно используются в области синтетической биологии. Однако до сих пор системы CFPS полагаются на круговые плазмиды, которые могут ограничить технологию от достижения ее полного потенциала. Подготовка плазмидной ДНК зависит от многих трудоемких этапов во время клонирования и большого количества выделения ДНК. С другой стороны, амплификация ПЦР из плазмиды или синтезированного шаблона ДНК может быть использована для простого приготовления шаблонов CFPS в течение нескольких часов 2,3. Поэтому применение линейной ДНК предлагает перспективное решение для CFPS. Однако линейная ДНК быстро разлагается экзонуклеазами, естественным образом присутствующими в клеточных экстрактах4. Существуют решения, которые решают эту проблему, такие как использование λ-фагового белка GamS5 или ДНК, содержащей сайты Chi6 в качестве защитных агентов, или прямая защита линейной ДНК путем химической модификации ее концов 2,7,8,9. Все эти методы требуют добавок к клеточному экстракту, которые являются дорогостоящими и трудоемкими. Давно известно, что комплекс экзонуклеазы V (RecBCD) разрушает линейную ДНК в клеточных лизатах4. Недавно мы показали, что линейная ДНК может быть гораздо лучше защищена в лизатах из клеток, выбитых для генов экзонуклеазы (recBCD)10.
В этом протоколе подробно описаны этапы получения бесклеточных лизатов из штамма E. coli BL21 Rosetta2 ΔrecBCD методом лизиса ультразвуком. Лизис ультразвуком является распространенным и доступным методом, используемым несколькими лабораториями11,12. Экстракты, полученные из этого штамма, не нуждаются в добавлении какого-либо дополнительного компонента или модификации шаблона ДНК для поддержки экспрессии из линейных шаблонов ДНК. Метод опирается на существенный этап оптимизации буфера для клеточных экстрактов специально для линейной экспрессии ДНК из нативных промоторов E. coli. Было показано, что эта специфическая оптимизация буфера для линейной экспрессии ДНК является ключом к тому, чтобы нативные промоторы σ70 давали высокую выработку белка без белка GamS или добавок ДНК Chi, даже избегая очистки продуктов ПЦР10. Было обнаружено, что оптимальная концентрация Mg-клея для линейной экспрессии ДНК аналогична концентрации для плазмидной ДНК. Однако оптимальная концентрация K-клея показала существенную разницу между линейной и плазмидной ДНК, вероятно, из-за механизма10, связанного с транскрипцией. Функциональность белков, экспрессируемых с помощью этого метода, была продемонстрирована для нескольких применений, таких как быстрый скрининг переключателей пальцев ног и оценка активности вариантов ферментов10.
Этот протокол обеспечивает простое, эффективное и экономичное решение для использования линейных шаблонов ДНК в бесклеточных системах E. coli путем простого использования мутантных экстрактов клеток ΔrecBCD и специальной калибровки для линейной ДНК в качестве шаблона.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы показываем, что клеточный лизат, полученный из E. coli BL21 Rosetta2 с геномным нокаутом для оперона recB или recBCD , поддерживает высокую экспрессию белка из линейных шаблонов ДНК. Этот протокол разрабатывает пошаговую процедуру калибровки лизата, специфичную для линейных ш?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACB и JLF признают финансовую поддержку гранта ANR SINAPUV (ANR-17-CE07-0046). JLF и JB признают финансовую поддержку гранта ANR SynBioDiag (ANR-18-CE33-0015). MSA и JLF признают финансовую поддержку гранта ANR iCFree (ANR-20-BiopNSE). JB подтверждает поддержку со стороны ERC, начиная с “COMPUCELL” (номер гранта 657579). Centre de Biochimie Structurale признает поддержку со стороны Французской инфраструктуры интегрированной структурной биологии (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01). МК признает финансовую поддержку со стороны департамента MICA INRAe, Университета Париж-Сакле, DIM-RFSI региона Иль-де-Франс (IdF) и ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003). Эта работа была поддержана финансированием через Премию консолидатора Европейского исследовательского совета (865973 CLB).
Materials
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
Referências
- Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
- McSweeney, M. A., Styczynski, M. P. Effective use of linear DNA in cell-free expression systems. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 715328 (2021).
- Schinn, S. -. M. Protein synthesis directly from PCR: progress and applications of cell-free protein synthesis with linear DNA. New Biotechnology. 33 (4), 8 (2016).
- Prell, A., Wackernagel, W. Degradation of linear and circular DNA with gaps by the recBC enzyme of Escherichia coli. Effects of gap length and the presence of cell-free extracts. European Journal of Biochemistry. 105 (1), 109-116 (1980).
- Sitaraman, K., et al. A novel cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 110 (3), 257-263 (2004).
- Marshall, R., Maxwell, C. S., Collins, S. P., Beisel, C. L., Noireaux, V. Short DNA containing χ sites enhances DNA stability and gene expression in E. coli cell-free transcription-translation systems. Biotechnology and Bioengineering. 114 (9), 2137-2141 (2017).
- Yim, S. S., Johns, N. I., Noireaux, V., Wang, H. H. Protecting linear DNA templates in cell-free expression systems from diverse bacteria. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2851-2855 (2020).
- Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens. ACS Synthetic Biology. 10 (7), 1615-1624 (2021).
- Zhu, B., et al. Increasing cell-free gene expression yields from linear templates in Escherichia coli and Vibrio natriegens extracts by using DNA-binding proteins. Biotechnology and Bioengineering. 117 (12), 3849-3857 (2020).
- Batista, A. C., et al. Differentially optimized cell-free buffer enables robust expression from unprotected linear DNA in exonuclease-deficient extracts. ACS Synthetic Biology. 11 (2), 732-746 (2022).
- Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. JoVE. (144), e58882 (2019).
- Kwon, Y. -. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J. L., Jo, Y. R., Reuel, N. F. Methods to reduce variability in E. Coli-based cell-free protein expression experiments. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Cole, S. D., et al. Quantification of interlaboratory cell-free protein synthesis variability. ACS Synthetic Biology. 8 (9), 2080-2091 (2019).
