선형 DNA 주형을 활용한 엑소뉴클레아제 결핍 세포 추출물의 무세포 단백질 합성
Summary
여기에 제시된 것은 대장 균 BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD 및 ΔrecB)의 엑소 뉴 클레아 제 V 녹아웃 균주로부터 세포 추출물의 제조 및 완충액 교정을위한 프로토콜입니다. 이것은 선형 DNA 주형을 사용하는 무세포 단백질 합성 시스템에서 발현을 위한 빠르고 쉽고 직접적인 접근 방식입니다.
Abstract
무세포 단백질 합성(CFPS)은 최근 수많은 장점으로 인해 합성 생물학 분야에서 매우 인기를 얻고 있습니다. CFPS에 선형 DNA 템플릿을 사용하면 클로닝, 형질 전환 및 플라스미드 추출 단계를 제거하여 실험 시간을 단축하여 기술이 잠재력을 최대한 발휘할 수 있습니다. 선형 DNA는 PCR에 의해 빠르고 쉽게 증폭되어 고농도의 주형을 얻을 수 있으므로 잠재적인 생체 내 발현 독성을 피할 수 있습니다. 그러나, 선형 DNA 주형은 세포 추출물에 자연적으로 존재하는 엑소뉴클레아제에 의해 빠르게 분해된다. 이 문제를 해결하기 위해 뉴클레아제 억제제를 추가하거나 보호를 위한 선형 DNA 말단의 화학적 변형과 같은 몇 가지 전략이 제안되었습니다. 이러한 모든 전략은 추가 시간과 자원을 소비하며 아직 플라스미드에 가까운 수준의 단백질 발현을 얻지 못했습니다. CFPS에 선형 DNA 템플릿을 사용하기 위한 대체 전략에 대한 자세한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 엑소뉴클레아제 결핍 녹아웃 세포의 세포 추출물을 사용하면 선형 DNA 주형이 최종 변형 없이 그대로 유지됩니다. 우리는 선형 DNA에 대해 특히 Mg-글루타메이트 (Mg-glu) 및 K- 글루타메이트 (K-glu)에 대한 초음파 용해 및 완충액 보정에 의한 대장균 BL21 Rosetta2 ΔrecBCD 균주에서 세포 용해물의 준비 단계를 제시합니다. 이 방법은 대장균 CFPS의 플라스미드 DNA와 유사한 단백질 발현 수준을 달성할 수 있습니다.
Introduction
무세포 단백질 합성(CFPS) 시스템은 바이오센서 엔지니어링, 분산 제조 및 유전자 회로의 프로토타이핑을 위한 빠르고 간단하며 효율적인 방법으로 점점 더 많이사용되고 있습니다1. CFPS 시스템은 큰 잠재력으로 인해 합성 생물학 분야에서 정기적으로 사용됩니다. 그러나 지금까지 CFPS 시스템은 기술이 잠재력을 최대한 발휘하는 것을 제한할 수 있는 원형 플라스미드에 의존합니다. 플라스미드 DNA를 준비하는 것은 클로닝 및 다량의 DNA 분리 중 많은 시간이 소요되는 단계에 따라 달라집니다. 반면에, 플라스미드 또는 합성된 DNA 주형으로부터의 PCR 증폭은 몇 시간 내에 CFPS 주형을 간단히 제조하는데 사용될 수 있다(2,3). 따라서 선형 DNA의 적용은 CFPS에 대한 유망한 솔루션을 제공합니다. 그러나, 선형 DNA는 세포 추출물4에 자연적으로 존재하는 엑소뉴클레아제에 의해 빠르게 분해된다. λ- 파지 GamS 단백질5 또는 카이 사이트6을 포함하는 DNA를 보호제로 사용하거나 말단 2,7,8,9의 화학적 변형으로 선형 DNA를 직접 보호하는 것과 같이이 문제를 해결하는 솔루션이 있습니다. 이러한 모든 방법은 세포 추출물에 대한 보충이 필요하며 비용과 시간이 많이 소요됩니다. 엑소 뉴 클레아 제 V 복합체 (RecBCD)가 세포 용해물4에서 선형 DNA를 분해한다는 것은 오랫동안 알려져 왔습니다. 최근에 우리는 선형 DNA가 엑소뉴클레아제 유전자(recBCD)10에 대해 녹아웃된 세포의 용해물에서 훨씬 더 잘 보호될 수 있음을 보여주었습니다.
이 프로토콜에서는 초음파 용해에 의한 대장균 BL21 Rosetta2 ΔrecBCD 균주로부터 무세포 용해물을 제조하는 단계를 자세히 설명합니다. 초음파 처리 용해는 여러 실험실11,12에서 사용하는 일반적이고 저렴한 기술입니다. 이 균주에서 생산된 추출물은 선형 DNA 주형으로부터의 발현을 지원하기 위해 추가 성분 또는 DNA 주형 변형을 추가할 필요가 없습니다. 이 방법은 특히 천연 대장균 프로모터의 선형 DNA 발현을 위한 세포 추출물에 대한 완충액 최적화의 필수 단계에 의존합니다. 선형 DNA 발현을 위한 이러한 특이적 완충액 최적화는 천연 σ70 프로모터가 PCR 산물10의 정제를 피하더라도 GamS 단백질 또는 Chi DNA 보충 없이 높은 단백질 생산을 산출하는 열쇠인 것으로 나타났습니다. 선형 DNA 발현을 위한 Mg-glu의 최적 농도는 플라스미드 DNA에 대한 농도와 유사한 것으로 밝혀졌다. 그러나, K-glu의 최적 농도는 전사 관련 메커니즘10에 기인 한 선형 및 플라스미드 DNA 사이에 상당한 차이를 보였다. 이 방법을 사용하여 발현된 단백질의 기능은 토홀드 스위치의 신속한 스크리닝 및 효소 변이체10의 활성 평가와 같은 여러 응용 분야에서 입증되었습니다.
이 프로토콜은 돌연변이 ΔrecBCD 세포 추출물과 선형 DNA에 대한 특정 보정을 주형으로 사용하여 대장균 무세포 시스템에서 선형 DNA 주형을 사용하기 위한 간단하고 효율적이며 비용 효율적인 솔루션을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서 우리는 recB 또는 recBCD 오페론에 대한 게놈 녹아웃을 가진 대장균 BL21 Rosetta2에서 준비된 세포 용해물이 선형 DNA 주형에서 높은 단백질 발현을 지원한다는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 선형 DNA 템플릿에 특이적인 단계별 용해물 보정 절차(그림 2)를 정교하게 설명하며, 이는 선형 DNA의 σ70 프로모터에서 높은 발현을 유도하여 등몰 DNA 농도에 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ACB와 JLF는 ANR SINAPUV 보조금(ANR-17-CE07-0046)의 자금 지원을 인정합니다. JLF와 JB는 ANR SynBioDiag 보조금(ANR-18-CE33-0015)의 자금 지원을 인정합니다. MSA와 JLF는 ANR iCFree 보조금(ANR-20-BiopNSE)의 자금 지원을 인정합니다. JB는 “COMPUCELL”(보조금 번호 657579)을 시작하는 ERC의 지원을 인정합니다. Centre de Biochimie Structurale은 프랑스 통합 구조 생물학 인프라 (FRISBI) (ANR-10-INSB-05-01)의 지원을 인정합니다. MK는 INRAe의 MICA 부서, Université Paris-Saclay, Ile-de-France (IdF) 지역의 DIM-RFSI 및 ANR DREAMY (ANR-21-CE48-003)의 자금 지원을 인정합니다. 이 연구는 유럽 연구위원회 통합 상 (865973 CLB)을 통한 자금 지원으로 지원되었습니다.
Materials
| 2-YT Broth | Invitrogen | 22712020 | |
| 1.5 mL Safe-Lock tubes | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL microtube |
| 384-well square-bottom microplate | Thermo Scientific Nunc | 142761 | |
| 3PGA (D-(-)-3-Phosphoglyceric acid disodium) | Sigma-Aldrich | P8877 | |
| adhesive plate seal | Thermo Scientific Nunc | 232701 | |
| Agar | Invitrogen | 30391023 | |
| ATP (Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| BL21 Rosetta2 | Merck Millipore | 71402 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecB | Addgene | 176582 | |
| BL21 Rosetta2 ΔrecBCD | Addgene | 176583 | |
| cAMP (Adenosine 3' 5'-cyclic monophosphate) | Sigma-Aldrich | A9501 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| CoA (Coenzyme A hydrate) | Sigma-Aldrich | C4282 | |
| Corning 15 mL PP Centrifuge Tubes, Rack Packed with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430790 | 15 mL tube |
| Corning 50 mL PP Centrifuge Tubes, Conical Bottom with CentriStar Cap, Sterile | Corning | 430828 | 50 mL tube |
| CTP (Cytidine 5'-triphosphate, disodium salt hydrate) | Alfa Aesar | J62238 | |
| DpnI | NEB | R0176S | |
| DTT (DL-Dithiothreitol) | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Folinic acid (solid folinic acid calcium salt) | Sigma-Aldrich | F7878 | |
| GTP (Guanosine 5ʹ-Triphosphate, Disodium Salt) | Sigma-Aldrich | 371701 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| K phosphate dibasic (K2HPO4) | Carl Roth | 231-834-5 | |
| K phosphate monobasic (H2KO4P) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| K-glutamate | Alfa Aesar | A17232 | |
| Mg-glutamate | Sigma-Aldrich | 49605 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone | Merck Millipore | SLGP033RB | membrane filter 0.22 µm |
| Monarch PCR & DNA Cleanup Kit | NEB | T1030S | PCR & DNA cleanup Kit |
| Monarch Plasmid Miniprep Kit | NEB | T1010S | Plasmid Miniprep Kit |
| NAD (B-nicotinamide adenine dinucleotide hydrate) | Sigma-Aldrich | N6522 | |
| NIST-traceable FITC standard | Invitrogen | F36915 | NIST-FITC |
| NucleoBond Xtra Maxi kit | Macherey-Nagel | 740414.1 | Plasmid Maxiprep Kit |
| PEG 8000 | Sigma-Aldrich | 89510 | |
| plate reader | Biotek | Synergy HTX | |
| Purified Recombinant EGFP Protein | Chromotek | egfp-250 | recombinant eGFP |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | NEB | M0492S | DNA polymerase |
| Q5 High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0492L | DNA polymerase |
| Qubit dsDNA BR Assay Kit | Thermo | Q32850 | fluorometric assay with DNA-binding dye |
| RTS Amino Acid Sampler | biotechrabbit | BR1401801 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | 85558 | |
| Sterile water | Purified water from the Millipore RiOs 8 system, sterilized by autoclaving. | ||
| Tris base | Life Science products Cytiva | 17-1321-01 | |
| tRNA | Roche | 10109550001 | |
| Ultrasonic processor Vibra cell VC-505 | SONICS | VC505 | sonicator |
| UTP Na3 (Uridine 5'- triphosphate, trisodium salt hydrate) | Acros Organics | 226310010 | |
| Water, nuclease-free | Thermo | R0581 | nuclease-free water |
Referências
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