Одномолекулярная диффузия и сборка на полимерно-переполненных липидных мембранах
Summary
Здесь представлен протокол для выполнения и анализа связывания, подвижности и сборки отдельных молекул на искусственных переполненных липидных мембранах с использованием одномолекулярной флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (smTIRF).
Abstract
Клеточные мембраны представляют собой сильно переполненные среды для биомолекулярных реакций и передачи сигналов. Тем не менее, большинство экспериментов in vitro , исследующих взаимодействие белка с липидами, используют голые двухслойные мембраны. Таким системам не хватает сложностей скученности мембранными белками и гликанами и исключают связанные с этим объемные эффекты, встречающиеся на поверхностях клеточных мембран. Кроме того, отрицательно заряженная стеклянная поверхность, на которой образуются липидные бислои, препятствует свободной диффузии трансмембранных биомолекул. Здесь мы представляем хорошо охарактеризованную полимерно-липидную мембрану в качестве имитации для переполненных липидных мембран. Этот протокол использует полиэтиленгликоль (ПЭГ)-конъюгированные липиды в качестве обобщенного подхода к включению краудеров в поддерживаемый липидный бислой (SLB). Сначала представлена процедура очистки микроскопических слайдов и обложек для выполнения одномолекулярных экспериментов. Далее обсуждаются методы характеристики PEG-SLB и проведения одномолекулярных экспериментов по связыванию, диффузии и сборке биомолекул с использованием одномолекулярного отслеживания и фотоотбеливания. Наконец, этот протокол демонстрирует, как контролировать нанопоровую сборку бактериального порообразующего токсина Cytolysin A (ClyA) на переполненных липидных мембранах с помощью одномолекулярного анализа фотоотбеливания. Коды MATLAB с примерами наборов данных также включены для выполнения некоторых общих анализов, таких как отслеживание частиц, извлечение диффузионного поведения и подсчет субъединиц.
Introduction
Клеточные мембраны представляют собой сильно переполненные и сложные системы1. Молекулярная скученность может оказывать значительное влияние на диффузию связанных с мембраной объектов, таких как белок и липиды 2,3,4. Аналогичным образом, на бимолекулярные реакции на липидных мембранах, такие как димеризация рецепторов или олигомеризация мембранных комплексов, влияют скученность 5,6,7. Природа, конфигурация и концентрация краудеров могут управлять мембранным связыванием, диффузионной активностью и белково-белковым взаимодействием несколькими способами 8,9. Поскольку контроль скученности мембран на клеточных мембранах и интерпретация ее влияния на встроенные биомолекулы является сложной задачей, исследователи попытались создать альтернативные системы in vitro 10.
Популярным подходом для искусственных переполненных мембран является легирование двухслойных мембран полимерными (такими как полиэтиленгликоль, ПЭГ) привитыми липидами11,12. Во время визуализации динамики белка и липидов на поддерживаемых липидных бислоях (SLB) эти полимеры дополнительно защищают мембранные компоненты от лежащей в основе отрицательно заряженной подложки (такой как стекло), эффективно поднимая бислой от основной опоры. Изменяя размер и концентрацию полимера, можно контролировать степень молекулярной скученности, а также ее отделение от лежащей в основе твердой опоры13,14. Это явно преимущество перед липидными бислоями, поддерживаемыми на твердых подложках без полимерных подушек15,16, где трансмембранные биомолекулы могут терять свою активность 17,18,19. Что еще более важно, это позволяет нам рекапитулировать переполненную среду клеточной мембраны in vitro, что имеет решающее значение для многих мембранных процессов.
Поверхностно-привитые полимеры на мембранах также претерпевают изменения в своей конфигурации в зависимости от их плотности прививки12. При низких концентрациях они остаются в энтропически свернутой конфигурации, известной как гриб, над поверхностью мембраны. С увеличением концентрации они начинают взаимодействовать и имеют тенденцию раскручиваться и расширяться, в конечном итоге давая плотное кустарниковое образование на мембране21. Поскольку переход от грибного к кустарниковому режиму отличается высокой неоднородностью и проявляется в плохо охарактеризованных условиях полимера, важно использовать хорошо охарактеризованные условия для скученности на полимерно-привитых мембранах. По сравнению с недавним исследованием20, мы идентифицируем и сообщаем о переполненных мембранных композициях, которые поддерживают диффузный транспорт и активность трансмембранных биомолекул.
В этом протоколе мы обсуждаем, как генерировать PEGylated липидные мембраны и предоставляем рекомендации для плотностей ПЭГ, которые имитируют скученность в двух разных режимах полимерной конфигурации (а именно, гриб и щетка). Протокол также описывает связывание одной молекулы, отслеживание частиц и сбор и анализ данных фотоотбеливания для молекул, встроенных в эти переполненные мембраны. Во-первых, мы описываем этапы тщательной очистки, сборку камеры визуализации и генерацию PEG-SLB. Во-вторых, мы предоставляем подробную информацию для экспериментов по связыванию одной молекулы, отслеживанию частиц и фотоотбеливанию. В-третьих, мы обсуждаем i) извлечение относительных сродств связывания, ii) характеристику молекулярной диффузии и iii) подсчет субъединиц в сборке белка из фильмов отдельных молекул на мембране.
Хотя мы охарактеризовали эту систему с помощью одномолекулярной визуализации, протокол полезен для всех мембранных биофизиков, заинтересованных в понимании влияния скученности на биомолекулярные реакции на липидные мембраны. В целом, мы представляем надежный конвейер для создания переполненных и поддерживаемых липидных бислоев, а также различные одномолекулярные анализы, проведенные на них, и соответствующие процедуры анализа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы демонстрируем одномолекулярные эксперименты на поддерживаемых липидных бислоях (SLB), которые демонстрируют переполненную среду для мембранных биомолекул. Переполненная среда генерирует эффект исключенного объема, приводящий к усилению биомолекулярныхреакций<s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают профессора Бенджамина Шулера за то, что он поделился экспрессионной плазмидой для белка ClyA. Эта работа была поддержана Программой Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).
Materials
| 2.5 ml Syringes | HMD Healthcare | Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin | Plastic syringe |
| Acetone | Finar Chemicals | 10020LL025 | |
| Acrylic Sheet | 2 mm thick | ||
| Acrylic Sheet | BigiMall | 2 mm, Clear | |
| Bath Sonicator | Branson | CPX-1800 | |
| Calcium Chloride | |||
| Chloroform | Sigma | 528730 | HPLC grade |
| Cholesterol | Avanti | 700100 | |
| Coplin Jar | Duran Wheaton Kimble | S6016 | 8 Slide Jar with Glass Cover |
| Coverslips | VWR | 631-1574 | 24 mm X 50 mm |
| Cy3-DNA Strand | IDT | GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3 |
|
| Cyanine Dye (Cy3) | Cytiva Life Sciences | PA23001 | |
| DiI | Invitrogen | D3911 | Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3))) |
| DNA Connector Strand 1 | Sigma Aldrich | GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T |
|
| DNA Connector Strand 2 | Sigma Aldrich | CGGACGCAATAGCAGCTCACAG TCGGTCACAT |
|
| DNA Tocopherol Strand | Biomers | Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA | |
| DOPE-PEG2000 | Avanti | 880130 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt) |
| Double Sided Tape | 3M | LF93010LE | |
| Drill Bits (Diamond Coated) | 0.5 – 1 mm | ||
| Drilling Machine | Dremel | 220 | Workstation |
| EMCCD | Andor | DU-897U-CS0-#BV | |
| Fluorescence Beads | Invitrogen | F10720 | |
| Glass Slides | Blue Star | Micro Slides, PIC-1 | |
| Glass Vials | Sigma | 854190 | |
| Hydrogen Peroxide | Lobachemie | 00182 | 30% Solution, AR Grade |
| Labolene | Thermo-Fischer Scientific | Detergent | |
| Laser 532 nm | Coherent | Sapphire | |
| Laser Cutter | Universal Laser Systems | ILS12.75 | |
| Lissamine Rhodamine DOPE | Avanti | 810150 | 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) |
| Methanol | Finar Chemicals | 30932LL025 | |
| Microscope | Olympus | IX81 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | 1X | ||
| Plasma Cleaner | Harrick Plasma Inc | PDC-002 | |
| POPC | Avanti | 850457 | 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine |
| Programmable Syringe Pump | New Era Pump Systems | NE1010 | High Pressure Syringe Pump |
| PTFE Caps | Sigma | 27141 | |
| PTFE Tubing | Cole-Parmer | WW-06417-21 | Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD |
| Sulphuric Acid | SD Fine Chemicals | 98%, AR Grade | |
| TIRF Objective | Olympus | UPLAPO100XOHR | |
| Vacuum Desiccator | Tarsons | ||
| Vortex Mixer | Tarsons |
References
- Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
- Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
- Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
- Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006 (2016).
- Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
- Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
- Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908 (2005).
- Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708 (2014).
- Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
- Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
- Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
- Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
- Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
- Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
- Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
- Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers – A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
- Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
- Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
- Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
- Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
- Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
- Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
- Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
- Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
- Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
- Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264 (2020).
- Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
- Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
- Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
- Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722 (2015).
- Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
- McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
- Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
- Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
- Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
- Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
- Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
- Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
- Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031 (2017).
- Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047 (2012).
- Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
- Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
- Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly – Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475 (2018).
- Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
- Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
- Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
- Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).
