JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Enmolekylär diffusion och montering på polymerträngda lipidmembran

Published: July 19, 2022
doi:
10.3791/64243
, , , , ,
1Department of Chemical Engineering,Indian Institute of Science, 2Holonyak Micro & Nanotechnology Lab,University of Illinois, Urbana-Champaign, 3Center for BioSystems Science and Engineering,Indian Institute of Science

Summary

Här presenteras ett protokoll för att utföra och analysera bindning, rörlighet och sammansättning av enskilda molekyler på artificiella trånga lipidmembran med hjälp av enmolekylär total intern reflektionsfluorescens (smTIRF) mikroskopi.

Abstract

Cellmembran är mycket trånga miljöer för biomolekylära reaktioner och signalering. Ändå använder de flesta in vitro-experiment som undersöker proteininteraktion med lipider nakna dubbelskiktsmembran. Sådana system saknar komplexiteten i trängsel av membraninbäddade proteiner och glykaner och utesluter de associerade volymeffekterna som uppstår på cellulära membranytor. Den negativt laddade glasytan på vilken lipid-dubbelskikten bildas förhindrar också fri diffusion av transmembranbiomolekyler. Här presenterar vi ett väl karakteriserat polymer-lipidmembran som en efterlikning för trånga lipidmembran. Detta protokoll använder polyetylenglykol (PEG) -konjugerade lipider som ett generaliserat tillvägagångssätt för att införliva crowders i det stödda lipid-dubbelskiktet (SLB). Först presenteras en rengöringsprocedur av mikroskopiska glidbanor och täckglas för att utföra enmolekylära experiment. Därefter diskuteras metoder för att karakterisera PEG-SLB: erna och utföra enmolekylära experiment av bindning, diffusion och sammansättning av biomolekyler med hjälp av enmolekylspårning och fotoblekning. Slutligen visar detta protokoll hur man övervakar nanoporsammansättningen av bakteriellt porbildande toxin Cytolysin A (ClyA) på trånga lipidmembran med enmolekylär fotoblekningsanalys. MATLAB-koder med exempeldatauppsättningar ingår också för att utföra några av de vanliga analyserna, till exempel partikelspårning, extrahering av diffusivt beteende och räkning av underenheter.

Introduction

Cellmembran är mycket trånga och komplexa system1. Molekylär trängsel kan ha en betydande inverkan på diffusionen av membranbundna enheter som protein och lipider 2,3,4. På liknande sätt påverkas bimolekylära reaktioner på lipidmembran som receptordimerisering eller oligomerisering av membrankomplex av trängsel 5,6,7. Crowders natur, konfiguration och koncentration kan styra membranbindningen, diffusiviteten och protein-proteininteraktionen på flera sätt 8,9. Eftersom det är utmanande att kontrollera membranträngsel på cellmembran och tolka dess påverkan på inbäddade biomolekyler, har forskare försökt etablera alternativa in vitro-system 10.

Ett populärt tillvägagångssätt för konstgjorda trånga membran är dopning av dubbelskiktsmembranen med polymer (såsom polyetylenglykol, PEG) -ympade lipider11,12. Under visualiseringen av protein- och lipiddynamik på stödda lipid-dubbelskikt (SLB) skyddar dessa polymerer dessutom de membraninbäddade komponenterna från det underliggande negativt laddade substratet (såsom glas) genom att effektivt lyfta dubbelskiktet bort från det underliggande stödet. Genom att variera polymerens storlek och koncentration kan man kontrollera omfattningen av molekylär trängsel, liksom dess separation från det underliggande fasta stödet13,14. Detta är helt klart en fördel jämfört med lipid-dubbelskikt som stöds på fasta substrat utan polymerkuddar15,16, där transmembranbiomolekyler kan förlora sin aktivitet17,18,19. Ännu viktigare är att det gör det möjligt för oss att rekapitulera den trånga miljön i cellmembranet in vitro, vilket är avgörande för många membranprocesser.

Ytympade polymerer på membran genomgår också förändringar i deras konfiguration beroende på deras ympningstäthet12. Vid låga koncentrationer förblir de i en entropiskt lindad konfiguration, känd som en svamp, ovanför membranytan. Med ökande koncentration börjar de interagera och tenderar att lossa och sträcka sig, vilket slutligen ger en tät borstliknande bildning på membranet21. Eftersom övergången från svampen till borstregimen är mycket heterogen och manifesterar sig i dåligt karakteriserade förhållanden hos polymeren, är det viktigt att använda väl karakteriserade förhållanden för trängsel på polymerympade membran. Jämfört med en nyligen genomförd studie20 identifierar och rapporterar vi trånga membrankompositioner som upprätthåller diffusiv transport och aktivitet av transmembranbiomolekyler.

I detta protokoll diskuterar vi hur man genererar PEGylerade lipidmembran och ger rekommendationer för PEG-densiteter som efterliknar trängsel i två olika regimer av polymerkonfiguration (nämligen svamp och borste). Protokollet beskriver också enmolekylbindning, partikelspårning och fotoblekning av datainsamling och analys för molekyler inbäddade i dessa trånga membran. Först beskriver vi de grundliga rengöringsstegen, monteringen av bildkammaren och genereringen av PEG-SLB. För det andra tillhandahåller vi detaljer för enmolekylbindnings-, partikelspårnings- och fotoblekningsexperiment. För det tredje diskuterar vi i) extrahering av de relativa bindningsaffiniteterna, ii) karakteriserande molekylär diffusion och iii) räkning av underenheter i en proteinsammansättning från filmer av enstaka molekyler på membranet.

Medan vi karakteriserade detta system med enmolekylavbildning, är protokollet användbart för alla membranbiofysiker som är intresserade av att förstå effekten av trängsel på biomolekylära reaktioner på lipidmembran. Sammantaget presenterar vi en robust pipeline för att göra trånga och stödda lipid-dubbelskikt, tillsammans med olika enmolekylära analyser som utförs på dem och motsvarande analysrutiner.

Protocol

1. Rengöring av objektsglas och täckglas för enmolekylära experiment Innan bildkammaren monteras, rengör och förbered både täckglas och glidbanor. Borra flera par hål på glasskivorna med en borrmaskin med diamantbelagda borrkronor (0,5-1 mm i diameter). Om akrylplåtar används, använd en laserskärare för att göra exakta hål (0,5 mm), som visas i figur 1.OBS: Varje par hål kommer att fungera som ett inlopp och utlopp för flödesutbyte för en i…

Representative Results

Övervakning av bindningen av ClyA-protein på PEGylerade membranEfter steg 4.5 uppskattas bindningskinetiken genom att plotta antalet partiklar som binder till membranytan över tid (Video 1). Eftersom ClyA-protein binder till ett membran med 5 mol% PEG2000-lipider ökar partikeldensiteten och når mättnad (figur 5). En exponentiell sönderfallspassning till de bundna partiklarna (cyancirklar) ger tidskonstanten (τb) för membranbindningen …

Discussion

Här demonstrerar vi enmolekylära experiment på stödda lipid-dubbelskikt (SLB) som manifesterar en trång miljö för membraninbäddade biomolekyler. Den trånga miljön genererar en utesluten volymeffekt, vilket leder till förbättring av biomolekylära reaktioner 1,2,39,40. För PEG-lipidsystemet, där polymeren primärt upptar volymen utanför dubbelskiktet, är denna effekt särskilt ut…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna erkänner professor Benjamin Schuler för att ha delat uttrycket plasmid för ClyA-protein. Detta arbete stöddes av Human Frontier Science Program (RGP0047-2020).

Materials

2.5 ml Syringes HMD Healthcare Dispo Van, 2.5 ml Tuberculin Plastic syringe
Acetone Finar Chemicals 10020LL025
Acrylic Sheet 2 mm thick
Acrylic Sheet BigiMall 2 mm, Clear
Bath Sonicator Branson CPX-1800
Calcium Chloride
Chloroform Sigma 528730  HPLC grade
Cholesterol Avanti 700100
Coplin Jar Duran Wheaton Kimble S6016 8 Slide Jar with Glass Cover
Coverslips VWR 631-1574 24 mm X 50 mm
Cy3-DNA Strand IDT GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT
GGTGTGGTTGG-Cy3
Cyanine Dye (Cy3) Cytiva Life Sciences PA23001
DiI Invitrogen D3911 Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate ('DiI'; DiIC18(3)))
DNA Connector Strand 1 Sigma Aldrich GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT
GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC
T
DNA Connector Strand 2 Sigma Aldrich CGGACGCAATAGCAGCTCACAG
TCGGTCACAT
DNA Tocopherol Strand Biomers Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA
DOPE-PEG2000 Avanti 880130 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (ammonium salt)
Double Sided Tape 3M LF93010LE
Drill Bits (Diamond Coated) 0.5 – 1 mm
Drilling Machine Dremel 220 Workstation
EMCCD Andor DU-897U-CS0-#BV
Fluorescence Beads Invitrogen F10720
Glass Slides Blue Star Micro Slides, PIC-1
Glass Vials Sigma 854190
Hydrogen Peroxide Lobachemie 00182 30% Solution, AR Grade
Labolene Thermo-Fischer Scientific  Detergent
Laser 532 nm Coherent Sapphire
Laser Cutter Universal Laser Systems ILS12.75
Lissamine Rhodamine DOPE Avanti 810150 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt)
Methanol Finar Chemicals 30932LL025
Microscope Olympus IX81
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1X
Plasma Cleaner Harrick Plasma Inc PDC-002
POPC Avanti 850457 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine
Programmable Syringe Pump New Era Pump Systems NE1010 High Pressure Syringe Pump
PTFE Caps Sigma 27141
PTFE Tubing Cole-Parmer WW-06417-21 Masterflex, 0.022" ID x 0.042" OD
Sulphuric Acid SD Fine Chemicals 98%, AR Grade
TIRF Objective Olympus UPLAPO100XOHR
Vacuum Desiccator Tarsons
Vortex Mixer Tarsons
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Löwe, M., Kalacheva, M., Boersma, A. J., Kedrov, A. The more the merrier: Effects of macromolecular crowding on the structure and dynamics of biological membranes. The FEBS Journal. 287 (23), 5039-5067 (2020).
  2. Kuznetsova, I. M., Turoverov, K. K., Uversky, V. N. What macromolecular crowding can do to a protein. International Journal of Molecular Sciences. 15 (12), 23090-23140 (2014).
  3. Horton, M. R., Höfling, F., Rädler, J. O., Franosch, T. Development of anomalous diffusion among crowding proteins. Soft Matter. 6 (12), 2648-2656 (2010).
  4. Jeon, J. H., Javanainen, M., Martinez-Seara, H., Metzler, R., Vattulainen, I. Protein crowding in lipid bilayers gives rise to non-Gaussian anomalous lateral diffusion of phospholipids and proteins. Physical Review X. 6 (2), 021006 (2016).
  5. Zhang, Y., et al. The influence of molecular reach and diffusivity on the efficacy of membrane-confined reactions. Biophysical Journal. 117 (7), 1189-1201 (2019).
  6. Loverdo, C., Bénichou, O., Moreau, M., Voituriez, R. Enhanced reaction kinetics in biological cells. Nature Physics. 4 (2), 134-137 (2008).
  7. Monine, M. I., Haugh, J. M. Reactions on cell membranes: Comparison of continuum theory and Brownian dynamics simulations. Journal of Chemical Physics. 123 (7), 074908 (2005).
  8. Berry, H. Anomalous diffusion due to hindering by mobile obstacles undergoing Brownian motion or Orstein-Ulhenbeck processes. Physical Review E. 89 (2), 22708 (2014).
  9. Saxton, M. J. Anomalous diffusion due to obstacles: A Monte Carlo study. Biophysical Journal. 66 (2), 394-401 (1994).
  10. Andersson, J., Fuller, M. A., Wood, K., Holt, S. A., Köper, I. A tethered bilayer lipid membrane that mimics microbial membranes. Physical Chemistry Chemical Physics. 20 (18), 12958-12969 (2018).
  11. Kaufmann, S., Papastavrou, G., Kumar, K., Textor, M., Reimhult, E. A detailed investigation of the formation kinetics and layer structure of poly(ethylene glycol) tether supported lipid bilayers. Soft Matter. 5 (14), 2804-2814 (2009).
  12. Marsh, D., Bartucci, R., Sportelli, L. Lipid membranes with grafted polymers: Physicochemical aspects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1615 (1-2), 33-59 (2003).
  13. Labouta, H. I., et al. Surface-grafted polyethylene glycol conformation impacts the transport of PEG-functionalized liposomes through a tumour extracellular matrix model. RSC Advances. 8 (14), 7697-7708 (2018).
  14. Lee, H., Larson, R. G. Adsorption of plasma proteins onto PEGylated lipid bilayers: The effect of PEG size and grafting density. Biomacromolecules. 17 (5), 1757-1765 (2016).
  15. Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view. Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).
  16. Andersson, J., et al. Solid-supported lipid bilayers – A versatile tool for the structural and functional characterization of membrane proteins. Methods. 180, 56-68 (2020).
  17. Duncan, A. L., et al. Protein crowding and lipid complexity influence the nanoscale dynamic organization of ion channels in cell membranes. Scientific Reports. 7 (1), 1-15 (2017).
  18. Garenne, D., Libchaber, A., Noireaux, V. Membrane molecular crowding enhances MreB polymerization to shape synthetic cells from spheres to rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 1902-1909 (2020).
  19. Pollock, N. L., Lee, S. C., Patel, J. H., Gulamhussein, A. A., Rothnie, A. J. Structure and function of membrane proteins encapsulated in a polymer-bound lipid bilayer. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1860 (4), 809-817 (2018).
  20. Coker, H. L. E., et al. Controlling anomalous diffusion in lipid membranes. Biophysical Journal. 116 (6), 1085-1094 (2019).
  21. Rex, S., Zuckermann, M. J., Lafleur, M., Silvius, J. R. Experimental and Monte Carlo simulation studies of the thermodynamics of polyethyleneglycol chains grafted to lipid bilayers. Biophysical Journal. 75 (6), 2900-2914 (1998).
  22. Hallett, F. R., Watton, J., Krygsman, P. Vesicle sizing number distributions by dynamic light scattering. Biophysical Journal. 59 (2), 357-362 (1991).
  23. Jin, A. J., Huster, D., Gawrisch, K., Nossal, R. Light scattering characterization of extruded lipid vesicles. European Biophysics Journal. 28 (3), 187-199 (1999).
  24. Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
  25. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. 50 (1), 1-13 (2009).
  26. Fiolka, R., Belyaev, Y., Ewers, H., Stemmer, A. Even illumination in total internal reflection fluorescence microscopy using laser light. Microscopy Research and Technique. 71 (1), 45-50 (2008).
  27. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  28. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5 (8), 695-702 (2008).
  29. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  30. Jarmoskaite, I., Alsadhan, I., Vaidyanathan, P. P., Herschlag, D. How to measure and evaluate binding affinities. eLife. 9, 57264 (2020).
  31. Sathyanarayana, P., et al. Cholesterol promotes Cytolysin A activity by stabilizing the intermediates during pore formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (31), 7323-7330 (2018).
  32. Mueller, M., Grauschopf, U., Maier, T., Glockshuber, R., Ban, N. The structure of a cytolytic alpha-helical toxin pore reveals its assembly mechanism. Nature. 459 (7247), 726-730 (2009).
  33. Hubicka, K., Janczura, J. Time-dependent classification of protein diffusion types: A statistical detection of mean-squared-displacement exponent transitions. Physical Review E. 101 (2), 1-13 (2020).
  34. Kepten, E., Weron, A., Sikora, G., Burnecki, K., Garini, Y. Guidelines for the fitting of anomalous diffusion mean square displacement graphs from single particle tracking experiments. PLoS ONE. 10 (2), 0117722 (2015).
  35. Persson, F., Lindén, M., Unoson, C., Elf, J. Extracting intracellular diffusive states and transition rates from single-molecule tracking data. Nature Methods. 10 (3), 265-269 (2013).
  36. McGuire, H., Aurousseau, M. R. P., Bowie, D., Blunck, R. Automating single subunit counting of membrane proteins in mammalian cells. The Journal of Biological Chemistry. 287 (43), 35912-35921 (2012).
  37. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. The Journal of General Physiology. 141 (6), 737-746 (2013).
  38. Zhang, H., Guo, P. Single molecule photobleaching (SMPB) technology for counting of RNA, DNA, protein and other molecules in nanoparticles and biological complexes by TIRF instrumentation. Methods. 67 (2), 169-176 (2014).
  39. Phillip, Y., Schreiber, G. Formation of protein complexes in crowded environments-From in vitro to in vivo. FEBS Letters. 587 (8), 1046-1052 (2013).
  40. Mittal, S., Chowhan, R. K., Singh, L. R. Macromolecular crowding: Macromolecules friend or foe. Biochimica et Biophysica Acta – General Subjects. 1850 (9), 1822-1831 (2015).
  41. Mashaghi, S., van Oijen, A. M. A versatile approach to the generation of fluid supported lipid bilayers and its applications. Biotechnology and Bioengineering. 111 (10), 2076-2081 (2014).
  42. Wong, W. C., et al. Characterization of single-protein dynamics in polymer-cushioned lipid bilayers derived from cell plasma membranes. The Journal of Physical Chemistry B. 123 (30), 6492-6504 (2019).
  43. Shashkova, S. S., Leake, M. C. Single-molecule fluorescence microscopy review: Shedding new light on old problems. Bioscience Reports. 37 (4), 20170031 (2017).
  44. Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. C. Advanced fluorescence microscopy techniques-FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM. Molecules. 17 (4), 4047 (2012).
  45. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  46. Carter, B. C., Vershinin, M., Gross, S. P. A comparison of step-detection methods: How well can you do. Biophysical Journal. 94 (1), 306-319 (2008).
  47. Otsuka, S., Ellenberg, J. Mechanisms of nuclear pore complex assembly – Two different ways of building one molecular machine. FEBS Letters. 592 (4), 475 (2018).
  48. Tsekouras, K., Custer, T. C., Jashnsaz, H., Walter, N. G., Pressé, S. A novel method to accurately locate and count large numbers of steps by photobleaching. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3601-3615 (2016).
  49. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Enumerating high numbers of fluorophores from photobleaching experiments: A Bayesian nonparametrics approach. bioRxiv. , (2020).
  50. Bryan, J. S., Sgouralis, I., Pressé, S. Diffraction-limited molecular cluster quantification with Bayesian nonparametrics. Nature Computational Science. 2 (2), 102-111 (2022).
  51. Kim, Y., et al. Efficient site-specific labeling of proteins via cysteines. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 786-791 (2008).

Tags

Single-molecule ImagingPolymer-crowded Lipid MembranesSupported Lipid BilayersMembrane Biomolecular ReactionsDiffusionAssemblyPOPCDOPE-PEG(2000)Small Unilamellar VesiclesSonicationMicrofluidic Imaging Chambers
check_url/64243?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Maurya, S., Rai, V. H., Upasani, A., Umrao, S., Parwana, D., Roy, R. Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes. J. Vis. Exp. (185), e64243, doi:10.3791/64243 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image