Pankreas Kanserini Modellemek için Sinjenik Fare Ortotopik Allogreftleri
Summary
Pankreatik duktal adenokarsinomun (PDAC) sinjenik fare ortotopik allogreftleri, hastalık alt tiplerinin biyolojisini, fenotiplerini ve terapötik yanıtlarını özetler. Hızlı, tekrarlanabilir tümör progresyonları nedeniyle, preklinik çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Burada, pankreasa sinjenik murin PDAC kültürleri enjekte ederek bu modelleri oluşturmak için ortak uygulamalar gösteriyoruz.
Abstract
Pankreatik duktal adenokarsinom (PDAC), çeşitli stroma, immün hücreler, damarlar, sinirler ve hücre dışı matriks bileşenlerinden oluşan heterojen bir tümör mikroçevresi ile karakterize çok karmaşık bir hastalıktır. Yıllar geçtikçe, ilerlemesinin, metastatik potansiyelinin ve fenotipik heterojenliğinin yarattığı zorlukları ele almak için farklı PDAC fare modelleri geliştirilmiştir. PDAC’nin immünkompetan fare ortotopik allogreftleri, genetiği değiştirilmiş fare modellerine kıyasla hızlı ve tekrarlanabilir tümör progresyonları nedeniyle iyi bir umut vaat etmektedir. Ayrıca, otokton PDAC’de gözlenen biyolojik özellikleri taklit etme yetenekleriyle birlikte, hücre çizgisi tabanlı ortotopik allogreft fare modelleri, büyük ölçekli in vivo deneylere olanak tanır. Bu nedenle, bu modeller hızlı genotip-fenotip ve ilaç-yanıt analizleri için klinik öncesi çalışmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu protokolün amacı, birincil fare PDAC hücre kültürlerini sinjenik alıcı farelerin pankreasına başarılı bir şekilde enjekte etmek için tekrarlanabilir ve sağlam bir yaklaşım sağlamaktır. Teknik detayların yanı sıra bu deneyleri yapmadan önce dikkat edilmesi gereken önemli bilgiler de verilmektedir.
Introduction
Son zamanlarda, PDAC batı dünyasında kansere bağlı ölümlerin üçüncü önde gelen nedeni haline geldi1. Tüm kanserler arasında en yüksek ölüm oranına ve on yıllardır değişmeyen ~% 1’lik 10 yıllık genel sağkalım oranına neden olur2. PDAC tedavisinde ilerleme kaydedilmemesi nedeniyle, bu hastalığın önümüzdeki on yılda kansere bağlı ölümlerin ikinci önde gelen nedeni haline gelmesi beklenmektedir3.
PDAC tümörleri, stroma, vasküler, immün ve hücre dışı matriks bileşenlerinin heterojen bir birleşiminden oluşan çeşitli tümör mikroçevresi (TME) ile karakterize kompleks antitelerdir4. TME’nin bileşimindeki farklılıklar hastalık prognozunu ve tedaviye yanıtı etkiler 4,5,6. Gerçekten de, birçok çalışma, PDAC’nin bazal benzeri, mezenkimal alt tipinin yüksek immünsüpresif bir TME ile ilişkili olduğunu ve sağkalımın azaldığını ve tedavilere yanıt eksikliğini gösterdiğini göstermiştir 7,8,9,10,11,12. Bu nedenle, TME kompozisyonundaki farklılıkların ve bu özelliklerin tümör biyolojisini nasıl etkilediğinin daha iyi anlaşılması, moleküler olarak kesin tedavilerin geliştirilmesi için önemli bir faktör olmaya devam etmektedir. Bu karmaşık fenotipin arkasındaki biyolojiyi daha iyi anlamak ve PDAC TME’sinin oluşturduğu engeli aşabilecek terapötik stratejileri tanımlamak için, in vivo modeller vazgeçilmezdir.
Herhangi bir kanser preklinik model sistemi için kilit bir husus, insan fenotiplerini taklit etmesi, hem genetik heterojenliği hem de TME’yi oluşturan çok sayıda stromal ve immün popülasyonu içeren ortamı özetlemesidir. Bu nedenle, klinik öncesi araştırmalar için fare modellerini seçerken, çeşitli hususlar dikkate alınmalıdır. Tümör-immün etkileşimini araştırmak için, histouyumlu kanser hücre hatları sinjenik immünokompetan farelere enjekte edilebilir. Çoğu durumda, bunlar farenin yan tarafına deri altından enjekte edilir ve palpasyon veya görsel muayene ile kolay tümör izlemesi sağlar. Bununla birlikte, ortaya çıkan modeller, menşe organlarındaki tümör hücrelerinin büyümesini taklit etmez. Bu nedenle ortotopik transplantasyonlar allogreft modelleri için altın standart haline gelmiştir.
Fare ortotopik allogreftlerinin birçok avantajı vardır: uygun maliyetlidirler, nispeten basit bir prosedürle üretilebilirler ve bilinen moleküler yapıya sahip modellerin yanı sıra tekrarlanabilir ve öngörülebilir bir tümör progresyonu ve fenotipine sahip modellerle sonuçlanırlar. Gerçekten de, hasta kaynaklı ksenogreft modelleri, insan PDAC hücrelerinin davranışını doğru bir şekilde temsil ederken, greft reddini önlemek için immün yetmezlikli farelere implantasyon ihtiyacı, tümör-immün ve tümör-stroma etkileşimlerinin analizini sınırlayarak, araştırmacıların bu tümörlerin karmaşıklığının yalnızca kısmi bir görüntüsünü yakalamalarına izin verir. PDAC’nin sinjenik ortotopik allogreftleri, genetiği değiştirilmiş fare modellerine (GEMM’ler) kıyasla bu konuda da avantajlıdır. GEMM’ler insan PDAC tümörigenezini ve PDAC hastalarında gözlenen heterojeniteyi doğru bir şekilde özetler. Ancak bu özelliklerinden dolayı GEMM tümörleri genetik yapılarında, tümör progresyonunda, agresifliğinde, histolojik farklılaşmasında ve TME kompozisyonunda yüksek varyans gösterebilir. Bu, bazı çalışmalarda bir avantaj olsa da, genotip-fenotip çalışmalarını ve PDAC fenotiplerinin odaklanmış araştırmasını sınırlar13. Bu nedenle fare ortotopik allogreftleri, tümör-konakçı ve tedavi çalışmalarını in vivo olarak gerçekleştirmek için iyi bir denge ve model oluşturmaktadır. Bu yazıda, murin PDAC hücrelerinin fare pankreasına ortotopik transplantasyon deneyleri için bir protokol özetlenmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sinjenik fare ortotopik allogreftleri, maliyet etkinlikleri, tekrarlanabilirlikleri ve nispeten basit deneysel prosedürleri nedeniyle klinik öncesi çalışmalar için sağlam bir model oluşturmaktadır13,15. Bu modeller sadece tümör-konakçı etkileşimlerinin incelenmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda deney için birincil fare hücre kültürleri kullanıldığında ortaya çıktıkları tümörlerin genetik heterojenliğinin korunmasını da garant…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TUM hayvan tesisine ve Nükleer Tıp Anabilim Dalı Klinikum rechts der Isar’ın görüntüleme çekirdek tesisine mükemmel teknik destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma Alman Kanser Konsorsiyumu (DKTK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG SA 1374/4-2, DFG SA 1374/6-1, SFB 1321 Project-ID 329628492 P06, P11 ve S01) tarafından D.S.’ye, Wilhelm Sander-Stiftung (2020.174.1 ve 2017.091.2) tarafından D.S.’ye ve Avrupa Araştırma Konseyi (ERC CoG No. 648521, D.S.) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 27 G cannula | B.Braun | 08915992 | |
| Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL) | Orion Corporation | 23554.00.00 | |
| Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm | Braintree Scientific | NC9334081 | |
| Dulbecco`s Modified Eagle Medium | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | |
| Eye cream (Bepanthen) | Bayer Vital GmbH | 1578675 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | S0615 | |
| Fentanyl (50 µg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 9113473 | |
| Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL) | Hameln pharma | 09611975 | |
| Medetomidine (Sedator 1 mg/mL) | Eurovet Animal Health BV | 400926.00.00 | |
| Meloxicam (Metacam 5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH | 3937902 | |
| Microliter syringe | Hamilton | HT80908 | |
| Midazolam (5 mg/mL) | Hexal | 00886423 | |
| NaCl | B. Braun | 2737756 | |
| Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL) | hameln pharma | 04464535 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | P7059-1L | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | |
| Suture (Ethilon) | Ethicon | 9999034 | |
| TrypZean Solution 1x | Sigma-Aldrich | T3449 |
Referências
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2020. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 70 (1), 7-30 (2020).
- Quaresma, M., Coleman, M. P., Rachet, B. 40-year trends in an index of survival for all cancers combined and survival adjusted for age and sex for each cancer in England and Wales, 1971-2011: A population-based study. Lancet. 385 (9974), 1206-1218 (2015).
- Rahib, L., Wehner, M. R., Matrisian, L. M., Nead, K. T. Estimated projection of US cancer incidence and death to 2040. JAMA Network Open. 4 (4), 214708 (2021).
- Schneider, G., Schmidt-Supprian, M., Rad, R., Saur, D. Tissue-specific tumorigenesis: Context matters. Nature Reviews Cancer. 17 (4), 239-253 (2017).
- Olive, K. P., et al. Inhibition of Hedgehog signaling enhances delivery of chemotherapy in a mouse model of pancreatic cancer. Science. 324 (5933), 1457-1461 (2009).
- Ruscetti, M., et al. Senescence-induced vascular remodeling creates therapeutic vulnerabilities in pancreas cancer. Cell. 181 (2), 424-441 (2020).
- Aung, K. L., et al. Genomics-driven precision medicine for advanced pancreatic cancer: Early results from the COMPASS trial. Clinical Cancer Research. 24 (6), 1344-1354 (2018).
- Chan-Seng-Yue, M., et al. Transcription phenotypes of pancreatic cancer are driven by genomic events during tumor evolution. Nature Genetics. 52 (2), 231-240 (2020).
- Kalimuthu, S. N., et al. Morphological classification of pancreatic ductal adenocarcinoma that predicts molecular subtypes and correlates with clinical outcome. Gut. 69 (2), 317-328 (2020).
- Hayashi, A., et al. A unifying paradigm for transcriptional heterogeneity and squamous features in pancreatic ductal adenocarcinoma. Nature Cancer. 1 (1), 59-74 (2020).
- Mueller, S., et al. Evolutionary routes and KRAS dosage define pancreatic cancer phenotypes. Nature. 554 (7690), 62-68 (2018).
- Falcomata, C., et al. Selective multi-kinase inhibition sensitizes mesenchymal pancreatic cancer to immune checkpoint blockade by remodeling the tumor microenvironment. Nature Cancer. 3 (3), 318-336 (2022).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- von Burstin, J., et al. E-cadherin regulates metastasis of pancreatic cancer in vivo and is suppressed by a SNAIL/HDAC1/HDAC2 repressor complex. Gastroenterology. 137 (1), 361-371 (2009).
- Mallya, K., Gautam, S. K., Aithal, A., Batra, S. K., Jain, M. Modeling pancreatic cancer in mice for experimental therapeutics. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1876 (1), 188554 (2021).
