Aloenxertos Ortotópicos Singênicos de Camundongos para Modelo de Câncer de Pâncreas

Summary

Aloenxertos ortotópicos singênicos de adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) de camundongos recapitulam a biologia, os fenótipos e as respostas terapêuticas dos subtipos da doença. Devido à sua rápida e reprodutível progressão tumoral, são amplamente utilizados em estudos pré-clínicos. Aqui, mostramos práticas comuns para gerar esses modelos, injetando culturas de PDAC murino singênico no pâncreas.

Abstract

O adenocarcinoma ductal pancreático (ADP) é uma doença muito complexa, caracterizada por um microambiente tumoral heterogêneo composto por um estroma diverso, células imunes, vasos, nervos e componentes da matriz extracelular. Ao longo dos anos, diferentes modelos de ADP em camundongos foram desenvolvidos para enfrentar os desafios impostos por sua progressão, potencial metastático e heterogeneidade fenotípica. Aloenxertos ortotópicos imunocompetentes de PDAC em camundongos têm se mostrado promissores devido à sua rápida e reprodutível progressão tumoral em comparação com modelos de camundongos geneticamente modificados. Além disso, combinados com sua capacidade de mimetizar as características biológicas observadas no ADP autóctone, modelos de camundongos aloenxertos ortotópicos baseados em linhagens celulares permitem experimentos in vivo em larga escala. Assim, esses modelos são amplamente utilizados em estudos pré-clínicos para análises rápidas genótipo-fenótipo e resposta a drogas. O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem reprodutível e robusta para injetar com sucesso culturas primárias de células PDAC em camundongos no pâncreas de camundongos receptores singênicos. Além dos detalhes técnicos, são dadas informações importantes que devem ser consideradas antes da realização desses experimentos.

Introduction

Recentemente, o ADP tornou-se a terceira causa de morte relacionada ao câncer no mundo ocidental¹. Causa a maior taxa de mortalidade entre todos os cânceres e uma taxa de sobrevida global de 10 anos de ~1%, que não mudou por décadas². Devido à falta de progresso no tratamento do ADP, espera-se que essa doença se torne a segunda causa de mortes relacionadas ao câncer na próxima década³.

Os tumores PDAC são entidades complexas caracterizadas por um microambiente tumoral (ETM) diverso, composto por um conjunto heterogêneo de estroma, componentes vasculares, imunes e da matriz^{extracelular4}. Diferenças na composição da ETM influenciam o prognóstico da doença e a resposta à terapia ^4,5,6. De fato, muitos estudos têm demonstrado que o subtipo mesenquimal basal da ADP está associado a uma ETM altamente imunossupressora e apresenta diminuição da sobrevida e ausência de resposta às terapias7,8,9,10,11,12. Portanto, uma compreensão mais profunda das diferenças na composição da EMT e como essas características influenciam a biologia tumoral continua sendo um fator importante para o desenvolvimento de terapias molecularmente precisas. Para melhor compreender a biologia por trás desse fenótipo complexo e identificar estratégias terapêuticas capazes de superar a barreira que a ETM do ADP constitui, modelos in vivo são indispensáveis.

Um aspecto chave para qualquer sistema modelo pré-clínico de câncer é que ele deve mimetizar fenótipos humanos, recapitulando tanto a heterogeneidade genética quanto o meio incorporando a multiplicidade de populações estromais e imunes que compõem a TME. Portanto, ao escolher modelos de camundongos para pesquisa pré-clínica, vários aspectos devem ser levados em consideração. Para investigar a interação tumor-imune, linhagens histocompatíveis de células cancerosas podem ser injetadas em camundongos imunocompetentes singênicos. Na maioria dos casos, estes são injetados por via subcutânea no flanco do rato, permitindo fácil monitorização tumoral por palpação ou inspeção visual. No entanto, os modelos resultantes não mimetizam o crescimento de células tumorais em seu órgão de origem. Portanto, o transplante ortotópico tornou-se o padrão-ouro para modelos de aloenxerto.

Os aloenxertos ortotópicos de camundongos apresentam várias vantagens: são custo-efetivos, podem ser gerados com um procedimento relativamente simples e resultam em modelos com composição molecular conhecida, bem como uma progressão tumoral e fenótipo reprodutível e previsível. De fato, enquanto os modelos de xenoenxerto derivados do paciente representam o comportamento das células PDAC humanas com precisão, a necessidade de implantação em camundongos imunodeficientes para evitar a rejeição do enxerto limita a análise das interações tumor-imune e tumor-estroma, permitindo que os pesquisadores capturem apenas uma imagem parcial da complexidade desses tumores. Os aloenxertos ortotópicos singênicos de ADP apresentam uma vantagem nesse sentido também em comparação com modelos de camundongos geneticamente modificados (GEMMs). Os GEMMs recapitulam com precisão a tumorigênese humana do ADP e a heterogeneidade observada em pacientes com ADP. No entanto, devido a essas características, os tumores GEMM podem apresentar alta variância em sua composição genética, progressão tumoral, agressividade, diferenciação histológica e composição da ETM. Embora isso possa ser uma vantagem em certos estudos, limita os estudos genótipo-fenótipo e a investigação focada dos fenótipos PDAC¹³. Portanto, aloenxertos ortotópicos de camundongos constituem um bom tradeoff e modelo para realizar estudos tumor-hospedeiro e tratamento in vivo. Este artigo descreve um protocolo para experimentos de transplante ortotópico de células PDAC murinas no pâncreas de camundongos.

Protocol

Os experimentos com animais foram aprovados pelos comitês institucionais de cuidados e uso de animais (IACUCs) das autoridades locais da Universidade Técnica de Munique e Regierung von Oberbayern. 1. Informações a considerar antes do procedimento Garantir a aprovação do protocolo animal e do pessoal pelas autoridades locais antes de iniciar qualquer experimentação animal. Selecione os mouses do destinatário.Selecionar camundongos de idades …

Representative Results

No contexto de um estudo de resposta a drogas em larga escala, implantamos com sucesso mais de 170 camundongos (camundongos receptores C75Bl6/J, machos e fêmeas com sexo pareado às linhagens celulares PDAC injetadas) usando o protocolo descrito acima, exemplificado em suas principais etapas na Figura 112. Neste protocolo, implantamos ortotopicamente três linhagens de células PDAC KrasG12D (PDAC 1 e 2: Ptf1aCre/+; LSL-KRASG12…

Discussion

Os aloenxertos ortotópicos singênicos de camundongos representam um modelo robusto para estudos pré-clínicos devido ao custo-efetividade, reprodutibilidade e procedimentos experimentais relativamente^simples13,15. Esses modelos não só permitem o estudo das interações tumor-hospedeiro, mas também garantem a preservação da heterogeneidade genética dos tumores de onde se originam quando culturas primárias de células de camundongo são utilizadas para o …

Materials

27 G cannula	B.Braun	08915992
Atipamezole (Antisedan 5 mg/mL)	Orion Corporation	23554.00.00
Autoclip Stainless Steel Wound Clips, 9 mm	Braintree Scientific	NC9334081
Dulbecco`s Modified Eagle Medium	Sigma-Aldrich	D5796-500ML
Eye cream (Bepanthen)	Bayer Vital GmbH	1578675
FBS	Sigma-Aldrich	S0615
Fentanyl (50 µg/mL)	Eurovet Animal Health BV	9113473
Flumazenile (Flumazenil-hameln 0.1 mg/mL)	Hameln pharma	09611975
Medetomidine (Sedator 1 mg/mL)	Eurovet Animal Health BV	400926.00.00
Meloxicam (Metacam 5 mg/mL)	Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH	3937902
Microliter syringe	Hamilton	HT80908
Midazolam (5 mg/mL)	Hexal	00886423
NaCl	B. Braun	2737756
Naloxone (Naloxon-hameln 0.4 mg/mL)	hameln pharma	04464535
PBS	Sigma-Aldrich	P7059-1L
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333-100ML
Suture (Ethilon)	Ethicon	9999034
TrypZean Solution 1x	Sigma-Aldrich	T3449