여기에 제시된 것은 면역 조직 화학을위한 포르말린 고정, 파라핀 내장 세포 펠릿 제어를 생성하기위한 프로토콜입니다.
표적 단백질의 발현이 알려진 양성 및 음성 대조군은 면역조직화학(IHC) 분석의 개발에 필수적입니다. 조직 대조군은 정의된 조직 및 세포 발현 패턴을 갖는 잘 특성화된 단백질에 유익하지만, 신규하거나 특성이 낮거나 유비쿼터스 발현된 단백질에 대한 IHC 분석의 초기 개발에는 적합하지 않습니다. 대안적으로, 표준화된 특성으로 인해, 정의된 단백질 또는 전사체 발현 수준(예: 고발현, 중간, 저발현)을 갖는 암 세포주, 형질감염된 과발현 세포주 또는 CRISPR과 같은 세포 공학 기술을 통해 결실된 유전자를 갖는 세포주를 포함한 세포 펠릿은 특히 초기 항체 특성화 및 선택에 유용한 대조군으로 작용할 수 있다. 이러한 세포 펠릿이 포르말린 고정, 파라핀 포매 조직에 대한 IHC 분석 개발에 사용되려면 조직 처리에 사용되는 절차를 요약하는 방식으로 처리 및 매립되어야 합니다. 이 프로토콜은 IHC 방법 개발에 사용할 수 있는 포르말린 고정, 파라핀 포매 세포 펠릿 제어를 만들고 처리하는 프로세스를 설명합니다.
면역조직화학(IHC)은 조사 및 진단 병리학에서 가장 일반적으로 사용되는 분석 중 하나입니다. 문맥과 분석에 따라 IHC는 암 진단1,2, 치료 반응예측 3,4, 병원체 식별5, 병든 조직의 세포 유형 특성화6, 생물학적 경로 및 조직 반응 연구 7,8에 사용됩니다. 모든 상황에서, IHC 분석의 기본 원리는 항체가 관심있는 표적, 가장 일반적으로 단백질에 특이적으로 결합하고, 이러한 결합 사건은 후속적으로 조직 섹션9에서 가시화된다는 것이다. 그러나 IHC 분석의 가장 큰 과제 중 하나는 항체가 관심 대상10을 특이적으로 검출하는지 확인하는 것입니다. 항체 특이성은 대부분의 면역분석법에서 어려운 과제이지만, 면역조직화학은 특이적 표지와 비특이적 표지를 구별하기 위한 분자량과 같은 2차 측정이 없다는 점에서 고유한 과제를 제시합니다. 이는 잘 정의된 세포 국소화 패턴이 없는 특성화가 불량하거나 유비쿼터스하게 발현된 표적을 평가할 때 특히 문제가 됩니다. 따라서, 결합 특이성을 특성화하는 것을 도울 수 있는 강력한 대조군은 새로운 IHC 분석법10을 개발할 때 매우 중요하다.
특징적인 세포 발현 패턴으로 잘 정의된 표적의 경우, 조직 제어는 IHC 방법 개발에 자주 활용됩니다. 풍부한 선행 데이터에 기초하여, 항체가 발현되는 것으로 알려진 조직, 세포 및 세포하 구획을 표지하고 있는지, 그리고 그것이 존재해서는 안 되는 조직 성분을 표지하고 있지 않은지를 결정할 수 있다(11). 그러나, 조직 대조군은 알려진 발현 패턴이 없는 잘 특성화되지 않은 신규한 표적 또는 널리 발현되고 뚜렷한 발현 패턴이 없는 단백질에 대해서는 제한적으로 사용된다. 이 두 시나리오 모두에서 잘 정의된 발현 패턴이 없기 때문에 조직에서 특이적 표지와 비특이적 표지를 구별하는 것이 불가능합니다. 이러한 상황에서, 세포 펠릿은 가치 있는 대안적 IHC 제어를 제공한다. 세포 펠릿 대조군은 다음을 포함할 수 있다: 관심 단백질의 내인성 또는 내인성/비유도 발현 수준을 갖고, 그의 단백질 발현이 웨스턴 블로팅, 유세포측정 분석에 의해 특성화될 수 있거나, 또는 전사 프로파일링으로부터 외삽될 수 있는 암 또는 다른 세포주; 관심있는 단백질을 과발현하거나 관심있는 암호화 유전자가 삭제 된 조작 된 세포주; 또는 관심 있는 단백질 발현 또는 신호 전달 이벤트(예: 인산화)를 유도하기 위해 특정 조건에서 처리된 세포10,12. 세포주에서 잘 특성화된 단백질 발현 수준은 또한 단백질 발현이 높은, 중간, 낮은, 없는 세포주의 패널을 사용하여 분석의 민감도를 평가할 수 있습니다. 부가적으로, 조작된 세포 펠릿은 수의학 종에 대한 가치 있는 종 특이적 대조군일 수 있으며, 이에 대해 제한된 특성화 또는 이용가능한 조직 대조군(13)이 있을 수 있다. 세포 펠릿은 조직에서 다양한 프로테옴을 반영하지 않는 세포주에 존재하는 제한된 프로테옴과 같은 그들의 한계를 가지고 있지만, 이들은 항체가 관심 표적을 검출할 수 있음을 확인하고 분석10에서 1차 항체, 2차 항체 또는 다른 리젠트에 의한 무차별 결합을 배제하기 위한 적절한 대조군으로서 기능한다.
진단 및 조사 병리학의 대부분의 조직은 중성 완충 포르말린에 고정되고 일련의 알코올로 탈수되고 크실렌에서 제거되고 파라핀 왁스에 가공 및 매립됩니다. 포르말린 고정 가교 단백질, 및 조직 처리의 고정 및 각 추가 단계는 단백질 및 이를 검출하는 항체의 능력에 직접적인 영향을 미칠 수 있습니다 9,14. 따라서 IHC 분석에 사용되는 모든 대조군이 동일한 고정, 조직 처리 및 매립 절차를 거치는 것이 중요합니다. 이 기사에서는 포르말린 고정 파라핀 포매 조직에서 IHC 분석을 개발하기 위한 대조군으로 사용하기 위해 배양된 세포를 처리하고 내장하기 위한 고유한 고려 사항을 설명하며, 방법론은 주로 조직학 실험실에서 세포 펠릿의 취급 및 처리에 중점을 둡니다.
이 프로토콜은 다운스트림 면역조직화학 및 현장 혼성화 연구를 위한 대조군으로 사용할 수 있는 포르말린 고정, 파라핀 포매 세포 펠릿을 생성하는 방법론을 설명합니다. 이 프로토콜에 기술된 조직학 방법론은 다양한 범위의 암 및 1차 세포주에 적용가능하며, 주로 이들 펠릿(17,18)을 생산하기 위해 일상적인 조직학 기술을 적응시킨다. 가공 및 매립될 때, 펠릿은 조직과 유사한 방식으로 사용될 수 있다. 여기에는 면역조직화학 실험을 위한 열 유도 및 효소 항원 검색 프로토콜과 함께 사용하는 것이 포함됩니다. 이 프로토콜에 사용되는 방법론의 한 가지 목표는 과정 전반에 걸쳐 세포의 형태와 항원성을 보존하는 것입니다. 따라서 형태와 항원 성 모두의 변화 측면에서 비교적 완만 한 EDTA는 세포를 분리하는 데 사용됩니다. 이것은 물리적 중단과 같은 다른 접근 방식이 실행 가능하지 않다는 것을 말하는 것이 아닙니다. 그러나 세포를 분리하는 모든 접근 방식은 그 과정에서 세포가 손상되지 않도록 해야 합니다. 이 프로토콜의 두 번째 목표는 동일한 고정제, 고정 비율, 처리 일정 (고정, 탈수, 제거 및 파라핀 침윤) 및 임베딩 기술을 사용하여 조직과 유사한 방식으로 세포를 고정하고 처리하여 다운 스트림 분석을위한 비교 가능한 제어 역할을 할 수 있도록하는 것입니다. 따라서 세포 펠릿을 생성하는 데 사용되는 고정 및 처리 접근법은 조직에 사용되는 접근법을 모방해야합니다.
이 보고서에 설명된 프로토콜은 고정 전에 세포를 분리, 수집 및 원심분리하기 때문에 병원성 박테리아 또는 바이러스에 감염된 세포와 같은 감염원이 있는 세포를 처리하는 데 적합하지 않습니다. 조사관은 분리 전에 세포를 고정하는 프로토콜을 고려할 수 있지만 세포 형태를 방해하지 않고 세포를 수집하려면 추가 최적화가 필요합니다. 또한 감염원이 있는 세포의 고정 시간 및 취급 조건은 감염원 및 관련 기관 생물안전 프로토콜에 따라 추가 고려 사항이 필요합니다.
포르말린 고정, 파라핀 포매 세포 펠릿은 잘 정의된 단백질 발현 수준10을 갖는 데 독특하게 유리합니다. 암 및 내인성 세포주는 다양한 수준의 단백질 발현을 가진 세포를 선택하지만, 유전 공학 기술을 통해 과학자들은 관심 단백질을 과발현하고 CRISPR 기술을 사용하여 관심 유전자를 절제하거나 삽입함으로써 단백질 발현을 모델링할 수 있습니다.20,21 . 세포주에서 과발현된 단백질의 단점은 내인성 단백질 수준22를 나타내지 않을 수 있기 때문에 분석의 민감도에 대한 측정이 좋지 않다는 것입니다. 대조적으로, 내인성 세포주와 암 세포주 모두 내인성 발현 수준을 더 잘 나타낼 수 있으며, 동족 계통에서 암호화 유전자의 CRISPR 매개 결실은 상응하는 음성 대조군으로 작용할 수 있습니다. 또한 다양한 수준의 단백질 발현을 가진 내인성 세포주 또는 암 세포주는 최종 항체 희석액을 선택하고 분석의 민감도를 가장 잘 이해하기 위한 적정 실험에 이상적입니다(그림 2). 사용할 세포주를 둘러싼 결정은 개별 실험 요구 사항을 기반으로 해야 하며 종종 접근 방식의 조합을 활용합니다.
항체가 관심 단백질을 검출할 수 있는지 여부를 평가하는 것 외에도 세포주 패널을 사용하여 항체의 특이성을 정의할 수 있습니다. 예를 들어, 밀접하게 관련된 단백질 패밀리를 개별적으로 발현하는 세포주 패널을 사용하여 항체가 개별 단백질에 특이적인지 또는 밀접하게 관련된 다른 단백질도 검출하는지 여부를 테스트할 수 있습니다. 보다 정교한 대조군은 CRISPR 녹인 또는 과발현을 통해 검출되고 있는 특정 신호 전달 이벤트(예: 인-특이적 항체를 평가할 때 특정 인산화 부위의 돌연변이)를 겪을 수 없는 점 돌연변이를 갖는 단백질을 발현하는 세포주를 사용하는 것을 포함할 수 있습니다. 이들은 더 복잡한 접근법이지만, 항체가 특정 상황10 하에서 표지만을 사용했음을 확인하는 데 필요할 수 있습니다.
세포주의 유전자 조작은 균질한 세포 집단을 생성하지 않을 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 과발현하는 세포주에서의 형질감염 효율은 전형적으로 100%가 아니며, 일부 세포는 관심있는 단백질을 과발현하지 않을 수 있다. 표준 방법으로 검출될 수 있는 형질감염 내에 FLAG 또는 관련 태그의 포함은 세포주(23)의 형질감염 효율을 평가하는데 도움이 될 수 있다. 이는 형질감염이 성공적이었는지 여부를 결정하고 단백질 발현으로 인한 검출 부족을 배제하고 관심 단백질을 발현해야 하는 세포의 예상 비율에 대한 참조 역할을 하는 데 도움이 될 수 있습니다.
계내 혼성화(ISH)는 또한 세포 펠릿에서 표적 유전자 발현을 특성화하고 IHC 방법 개발10을 알리는 유익한 도구가 될 수 있습니다. 항체를 스크리닝할 때 전사체와 잠재적 단백질이 언제 검출될 수 있는지 아는 것은 유익할 수 있습니다. 또한 세포 펠릿 ISH 스크리닝은 ISH 방법 개발에 도움이 될 수 있습니다. 특이성은 ISH 분석에서 덜 자주 문제가되지만 ISH 연구에 적용 할 수있는 대조군의 개발 및 활용에 대해 적절한 대조군 및 유사한 고려 사항을 갖는 것이 여전히 중요합니다.
조직 마이크로어레이는 공여체 블록에서 코어를 제거하고 종종 그리드 패턴으로 이러한 코어를 수용자 파라핀 블록으로 전달하여 생성됩니다. 결국, 수용자 블록은 단일 블록 내에 샘플들의 스펙트럼을 포함하여, 블록 내의 모든 샘플들이 동일한 IHC 절차를 거치도록 하고, 동일한 슬라이드(24, 25) 상의 다수의 샘플들의 직접 비교를 허용한다. 세포 펠릿은 비교적 균일한 집단이기 때문에 1mm 코어로 정확하게 나타낼 수 있어 유사한 어레이에 포함하기에 이상적인 후보입니다. 세포 펠릿 어레이를 사용하면 다양한 수준의 발현을 갖는 세포 펠릿, 관련 단백질을 고유하게 발현하는 세포 펠릿, 다양한 종의 관심 단백질의 오르토로그를 발현하는 세포 펠릿을 단일 슬라이드에 포함할 수 있습니다(그림 3). 이는 모든 세포 펠릿이 신속한 방식으로 균일한 조건 하에서 동시에 평가될 수 있게 하고, 시약(25)의 사용을 최소화한다.
이 프로토콜에는 8개의 T175 플라스크에서 수집한 2mL의 최소 시작 세포 펠릿 부피가 권장됩니다. 이 부피는 여러 세포 펠릿 블록의 생산 및 보관을 허용하므로 세포 펠릿 제어를 장기간에 걸쳐 표준화하고 주어진 펠릿에서 여러 세포 펠릿 어레이를 만들 수 있습니다. 더 낮은 세포 펠릿 부피는 1차 환자 유래 세포주, 느리게 성장하는 세포주를 다룰 때 또는 조건이 샘플의 부피를 제한할 때 사용할 수 있습니다. 물론, 더 낮은 시작 부피는 펠릿의 고정 및 준비 중 세포 손실로 인한 부정적인 영향을 강화하고 다운스트림 공정에 사용할 수 있는 재료를 제한합니다. 원심분리 후 정착액을 제거할 때 관련 손실을 최소화하기 위해 주의하는 것이 특히 중요합니다. 시료량을 줄이려면 1.5mL 캡이 있는 원심분리 튜브를 사용하여 세포를 펠릿화할 수 있습니다. 이 튜브는 가공을 위해 블레이드로 세로로 이등분될 수 있습니다.
조직 고정과 유사하게, 이 펠릿 내의 세포 고정은 다운스트림 IHC 평가에 매우 중요합니다. 완전한 고정을 달성하기 위해 최소 10:1 포르말린 대 세포 펠릿 비율을 사용하고 원추형 튜브를 반전시켜 세포를 현탁액으로 유지합니다. 고정 시 세포가 현탁 상태에 있지 않으면 불완전하거나 부적절한 고정의 위험이 있으며, 이는 다운스트림 면역표지에 영향을 미칩니다. 종종 이것은 주변부의 강력한 라벨링과 펠릿 중앙의 라벨링 손실 또는 펠릿 전체에 걸쳐 다양한 강도의 라벨링으로 나타납니다.
이 프로토콜은 주로 하이드록시에틸 아가로스로 구성된 히스토겔을 사용하여 세포 펠릿에 결합하고 세포가 세포 펠릿 전체에 고르게 분포되도록 합니다. 그것 없이는 세포가 압축되어 세포 형태 학적 세부 사항을 잃게됩니다. 이러한 세포형태학적 세부사항은 항체가 적절한 세포내 구획(예를 들어, 핵, 세포질 또는 원형질막)에 표지되고 있는지에 관한 추가 정보를 제공하기 때문에 항체 스크리닝 중에 종종 중요하다. 대조적으로, 너무 많은 젤은 펠릿 내의 세포 밀도를 낮추어 세포가 널리 분포되고 섹션당 세포 수를 감소시킬 수 있습니다.
이 프로토콜은 IHC 제어를 개발하는데 일상적으로 사용될 수 있다. 이러한 펠릿을 만드는 데 필요한 재료는 조사 생물학 및 조직학 실험실에서 일반적이며 방법은 간단하고 적응하기 쉽습니다. 세포 펠릿은 IHC 대조군으로서 한계가 있지만 초기 항체 스크리닝을 위한 훌륭한 도구 역할을 하고 다른 조직 대조군을 보완합니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 Genentech의 연구 조직, 특히 수년 동안 이러한 방법의 개발에 기여한 병리학 핵심(P-코어) 실험실의 동료들의 협력을 인정하고 싶습니다.
10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
50 mL Conical Tube | Becton Dickinson Labware | #0747-1886 | |
70% Ethanol | Koptec | V1401 | |
95% Ethanol | Koptec | V1101 | |
Biopsy Wraps | Surgipath Medical Industries, Inc | #01090 | |
Costar Stripette serological pipette 10mL | Corning | CLS4101 | |
Flex 100 | Epredia | 8101 | |
Flex 95 | Epredia | 8201 | |
Histogel | Thermo Scientific | #R904012 | |
Leica Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
Micro Spatula, rounded and tapered ends | Tedd Pella | #13510 | |
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin | Surgipath | 39601006 | |
Pipette Controller | CAPP | PA-100 | |
Reagent Alcohol | Epredia | 9111 | |
Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | #RS-9522 | |
Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette | Epredia | B851120WH | |
TMA Tissue Grand Master | 3DHistech LTD | ||
Xylenes | VWR | 89370-088 |